ОБНАРУЖЕНИЕ РНК SARS-COV-2 В НОСОГЛОТОЧНЫХ МАЗКАХ БОЛЬНЫХ COVID-19 И БЕССИМПТОМНЫХ НОСИТЕЛЕЙ МЕТОДАМИ ЦИФРОВОЙ ПЦР И ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ

Аннотация

В настоящей работе была проведена апробация двух разработанных нами наборов реагентов для обнаружения РНК SARS-CoV-2 по фрагменту гена ORF1ab в формате цифровой ПЦР и ПЦР в реальном времени. Были получены данные по выявлению РНК вируса SARS-CoV-2 в носоглоточных мазках больных COVID-19 и бессимптомных носителей. Разработанные наборы реагентов обеспечивали 100% чувствительность и предел детекции в 103 ГЭ/мл для qPCR, и не менее 200 копий/мл вирусной РНК при проведении цифрового ПЦР. Выполнена апробация этих методов с помощью панели из 1328 образцов, собранных от пациентов с подозрением на COVID-19 в начале 2020 г. на территории РФ. Показано, что dPCR более чувствителен и может быть использован для анализа образцов с низкой вирусной нагрузкой, в том числе от пациентов без клинических симптомов. dPCR значительно повышает точность лабораторного исследования и существенно снижает число ложноотрицательных результатов при диагностике SARS-CoV-2. Определение концентрации РНК SARS-CoV-2 у пациентов с различным клиническим течением заболевания показало, что концентрация вирусной РНК может резко снижаться в первые дни заболевания. Низкая концентрация вирусной РНК в пробах от пациентов также характерна при бессимптомном течение заболевания. Метод цифровой ПЦР обеспечивает более высокую выявляемость бессимптомных случаев заболевания, которая составляет приблизительно 75 % от числа инфицированных, в отличие от 45% выявляемости методом ПЦР в реальном времени. Полученные результаты по использованию метода цифровой ПЦР для детекции РНК SARS-CoV-2 показали, что этот метод особенно подходит для выявления РНК в случае ее низкой концентрации у контактных, а также для мониторинга изменения вирусной нагрузки у выздоравливающих пациентов.

Об авторах

Список литературы

Zhu N., Zhang D., Wang W. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. N. Engl. J. Med. 2020; 382:727-33.

Walls A.C., Park Y.J., Tortorici M.A., Wall A., McGuire A.T., Veesler D. Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein. Cell. 2020; 181(2):281-92.e6. doi: 10.1016/j.cell.2020.02.058. Epub 2020 Mar 9.

Qiu F., Wang H., Zhang Z., Cao L., Wang C., Wu J., Du Q. Laboratory testing techniques for SARS-CoV-2. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2020; 40(2):164-7. doi: 10.12122/j.issn.1673-4254.2020.02.04.

Tao Zhang, Qunfu Wu, Zhigang Zhang. Probable Pangolin Origin of SARS-CoV-2 Associated With the COVID-19 Outbreak. Curr. Biol. 2020;30 (7): 1346-51.

Hoffmann M., Kleine-Weber H., Pöhlmann S. A Multibasic Cleavage Site in the Spike Protein of SARS-CoV-2 Is Essential for Infection of Human Lung Cells. Molecular Cell. 2020; DOI: 10.1016/j.molcel.2020.04.022.

Zhai P., Ding Y., Wu X., Long J., Zhong Y., Li Y. The epidemiology, diagnosis and treatment of COVID-19. Int. J. Antimicrob. Agents. 2020 May;55(5):105955. doi: 10.1016/j.ijantimicag.2020.105955. Epub 2020 Mar 28. PMID: 32234468.

https://jamanetwork.com/journals/jama/fullarticle/2765837?guestAccessKey=61b73a23-25e1-46bd-96c5-cf0ec847df25&utm_source=twitter&utm_medium=social_ jama&utm_term=3324078795&utm_campaign=article_alert&linkId=88064719.

Quan P-L., Sauzade M., Brouzes E. dPCR: A Technology Review Sensors (Basel). 2018 Apr; 18(4): 1271. Published online 2018 Apr 20. doi: 10.3390/s18041271.

Hindson B.J., Ness K.D., Masquelier D.A., Belgrader P., Heredia N.J., Makarewicz A.J. et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal. Chem. 2011;83: 8604-10.

Hindson C.M., Chevillet J.R., Briggs H.A., Gallichotte E.N., Ruf I.K., Hindson B.J. et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nature methods. 2013;10:1003-5.

Vogelstein B., Kinzler K.W. Digital pcr. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1999; 96:9236-41.

Dingle T.C., Sedlak R.H., Cook L., Jerome K.R. Tolerance of droplet-digital PCR VS real-time quantitative PCR to inhibitory substances. Clinical chemistry. 2013;59:1668-70.

Cергеева Е.И., Терновой В.А., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно меченых зондов для идентификации РНК коронавирусов видов 229Е, NL63, OC43, HKU1 методом гибридизационно-флуоресцентной обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции. Патент РФ № 2473702; 2011

Li Y.C., Bai W.Z., Hashikawa T. The neuroinvasive potential of SARS-CoV2 may play a role in the respiratory failure of COVID-19 patients. J. Med. Virol. 2020 Jun; 92(6):552-5. doi: 10.1002/jmv.25728. Epub 2020 Mar 11.

Madabhavi I., Sarkar M., Kadakol N. COVID-19: a review. Monaldi Arch. Chest. Dis. 2020 May 14; 90(2). doi: 10.4081/monaldi.2020.1298. PMID: 32498503.

Singhal T. A Review of Coronavirus Disease-2019 (COVID-19). Indian J. Pediatr. 2020 Apr;87(4):281-6. doi: 10.1007/s12098-020-03263-6. Epub 2020 Mar 13. PMID: 32166607.

Tian S., Hu W., Niu L., Liu H., Xu H., Xiao S.Y. Pulmonary Pathology of Early-Phase 2019 Novel Coronavirus (COVID-19) Pneumonia in Two Patients With Lung Cancer. J. Thorac. Oncol. 2020 May;15(5):700-4. doi: 10.1016/j.jtho.2020.02.010. Epub 2020 Feb 28. PMID: 32114094.

Cергеева Е.И., Терновой В.А., Агафонов А.П., Сергеев А.Н. Набор олигодезоксирибонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченого зонда для идентификации РНК коронавируса человека, ассоциированного с тяжелым острым респираторным синдромом. Патент РФ № 2504585; 2012.

Сергеева Е.И., Терновой В.А., Демина О.К., Демина А.В., Корнеев Д.В. и др. Разработка и испытание мультиплексной пцр в режиме реального времени для идентификации вирусов, вызывающих острые респираторные инфекции человека. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2013; 4 : 32-7.

Wu Y., Strain M.C., Lada S.M., Luong T., Rought S.E., Gianella S., et al. Highly precise measurement of HIV DNA by droplet digital PCR. PLoS ONE. 2013; 8:e55943.

Daniel W.T., Kristian L. M.D., Marina K., David A.A., Patricia E.G., Robert L.J. et al. Protocols for determination of limits of detection and limits of quantitation; approved guideline. CLSI EP17-A; 24(34).

Huggett J.F., Foy C.A., Benes V., Emslie K, Garson J.A., Haynes R. et al. The digital MIQE guidelines: Minimum Information for Publication of Quantitative Digital PCR Experiments. Clinical Chemistry. 2013;59:892-902.

Weaver S., Dube S., Mir A., Qin J., Sun G., Ramakrishnan R. Taking qPCR to a higher level: Analysis of CNV reveals the power of high throughput qPCR to enhance quantitative resolution. Methods. 2010;50:271-6.

He X., Lau E.H.Y., Wu P., Deng X., Wang J., Hao X., et al. Temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19. Nat. Med. (2020). https://doi.org/10.1038/s41591-020-0869-5

Yang Y., Yang M., Shen C., Wang F., Yuan J., Li J. et al. Evaluating the accuracy of different respiratory specimens in the laboratory diagnosis and monitoring the viral shedding of 2019-nCOV infections. MedRxiv 2020.02.11.20021493. https://doi.Org/10.1101/2020.02.11.20021493.

Rothe C., Schunk M., Sothmann P., Bretzel G., Froeschl G., Wallrauch C., et al. Transmission of 2019-nCoV Infection 245 from an Asymptomatic Contact in Germany. N. Engl. J. Med. 2020. DOI: 10.1056/NEJMc2001468.

Lianhua Dong, Junbo Zhou,Chunyan Niu, Quanyi Wang, Yang Pan, Xia Wang et al. Highly accurate and sensitive diagnostic detection of SARS-CoV-2 by digital PCR. medRxiv 2020.03.14.20036129; DOI: 10.1101/2020.03.14.20036129.

Ai T., Yang Z., Hou H., Zhan C., Chen C., Lv W. et al. Correlation of chest Ct and RT-PCR testing in coronavirus disease 2019 (COVID-19) in China: A report of 1014 cases. Radiology. 2020:200642.

Whale A.S., Jones G.M., Jernej P., Dreo T., Redshaw N., Akyürek S. et al. Assessment of digital PCR as a primary reference measurement procedure to support advances in precision medicine. Clinical Chemistry. 2018;64:1296-307.

Lauer S.A., Grantz K.H., Bi Q., Jones F.K., Zheng Q., Meredith H.R. et al. The Incubation Period of Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) From Publicly Reported Confirmed Cases: Estimation and Application. Ann. Intern. Med. 2020 May 5;172(9): 577-82. doi: 10.7326/M20-0504. Epub 2020 Mar 10.

Ключевые слова