РАЗРАБОТКА И ВАЛИДАЦИЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ СИСТЕМЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПАРАФИНА ДЛЯ ПЦР

Аннотация

Классические наборы для выявления инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), как правило,
требуют проведения нескольких манипуляций: начиная от внесения самого образца в каждую пробирку, до раскапывания и
приготовления реакционной смеси, с их последующим добавлением к образцу. Проведения всех этих этапов удлиняет работу
работников лабораторий и увеличивает время выдачи результатов. В данном исследовании для наборов ПЦР был внедрен
метод разделения смеси с помощью высокоочищенного парафина. Используя этот метод, все компоненты были предварительно разделены в виде ″сандвича‶, к которым можно добавить сразу образец. Поскольку такое разделение не требует
дополнительных процедур, рабочие этапы при подготовке к постановке в прибор упрощены, что уменьшает ошибки дозирования реакционной смеси. В ходе исследования было протестировано несколько различных комбинаций как самого чистого
парафина и воска в пастилах EMPROVE® ESSENTIAL, так и их смесей с другими веществами. Проведено доказательное
сравнение работоспособности и валидация системы композиции парафина с TWEEN® 85 по сравнению с классической подготовкой ПЦР перед постановкой в прибор, а также сравнение разрабатываемой композиции относительно очищенного воска Chill-out™ Liquid Wax. Кроме того, 2 смеси с парафином, используемые для обнаружения различных мишеней рибонуклеиновой кислоты (РНК) и дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) оказались стабильными при температуре хранения при -20
°C. Периоды оценки смесей с парафином для ПЦР проводились с периодичностью 3 раза в неделю в течение четырех месяцев.
По результатам данных, полученных в ходе проводимых разработок, доказана возможность использования разработанной
композиции парафина с TWEEN® 85. Это исследование и его результаты важны для развития молекулярной диагностики и
использования данной системы, как в крупных лабораториях, так и в лабораториях с небольшой загруженностью.

Annotation

Classic kits for detection of infectious diseases by polymerase chain reaction (PCR) usually require several manipulations: from pipetting the sample itself into each tube, to the introduction and preparation of the reaction mixture, and their subsequent addition to the
sample. Carrying out all these steps lengthens the work of laboratory staff and increases the time it takes to issue results. In this study,
a method of mixture separation using highly purified paraffin wax was implemented for PCR kits. Using this method, all components
were pre-separated as a ″sandwich‶ to which the sample can be added at once. Since this separation does not require additional
procedures, the work steps in preparation for staging in the device are simplified, reducing the dosing errors of the reaction mixture.
Several different combinations of both the purest paraffin and wax in EMPROVE® ESSENTIAL pastilles and their mixtures with other
substances were tested. A proof-of-concept comparison of the performance and validation of the paraffin wax composition system with
TWEEN® 85 versus the classical PCR preparation prior to staging in the instrument was performed, as well as a comparison of the
developed composition relative to purified Chill-out™ Liquid Wax. In addition, 2 paraffin wax mixtures used for the detection of different targets (ribonucleic acid (RNA) and deoxyribonucleic acid (DNA)) were shown to be stable at storage temperatures of — 20 °C.
Evaluation periods of the paraffin-embedded PCR mixtures were carried out at a frequency of 3 times per week for four months. Based
on the results of the data obtained from the ongoing development work, the feasibility of the developed paraffin wax composition with
TWEEN® 85 was proven. This study and its results are important for the development of molecular diagnostics and the use of this
system both in large laboratories and in laboratories with small workloads.
Key words: рaraffin; wax; paraffin composition; amplification schedule; stability; validation

Об авторах

Список литературы

1. Rebrikov D.V. Real-time PCR. Moscow: Laboratoriya znaniy; 2015.
(in Russian)
2. Zhigaleva O.N., Il’in I.I., Mardanly S.G., Mardanly S.S. Development
of a set of reagents for the isolation of nucleic acids from clinical
material based on magnetic adsorption. Klinicheskaya Laboratornaya
Diagnostika. 2023; 68 (10): 650-7. DOI: 10.51620/0869-2084-2023-
68-10-650-657. (in Russian)
3. Quantitative PCR Basics 2024. Available at: https://www.
sigmaaldrich.com/RU/en/technical-documents/technical-article/
genomics/qpcr/quantitative-pcr (5 February 2024).
4. Harshitha R., Arunraj D. R. Real-time quantitative PCR: A tool for
absolute and relative quantification. Biochem. Mol. Biol. Educ. 2021;
49(5): 800–12. DOI: 10.1002/bmb.21552.
5. Zhigaleva O.N., Mardanly S.G., Gashenko T.Yu., Ermolaev I.I. Development of a reagent kit for the quantitative determination of hepatitis B virus (HBV) DNA in cMaterial by PCR with hybridizationfluorescence detection. Epidemiologiya i Vaktsinoprofilaktika. 2023;
22(4): 86-93. DOI: 10.31631/2073-3046-2023-22-4-86-94. (in Russian)
6. Bloch W., Cerrito E., Raymond J., Oakland, Read R. A., Alameda
Use of grease or wax in the polymerase chain reaction. Patent US
US5411876A; 1995.
7. Federal service for Surveillance in Healthcare ( State register of medical devices and organizations (individual entrepreneurs) engaged in
the production and manufacture of medical devices) [Federal’naya
sluzhba po nadzoru v sfere zdravookhraneniya (Gosudarstvennyy
reestr meditsinskikh izdeliy i organizatsiy (individual’nykh predprinimateley), osushchestvlyayushchikh proizvodstvo i izgotovlenie
meditsinskikh izdeliy)]. Available at: https://www.roszdravnadzor.
gov.ru/services/misearch (12 February 2024). (in Russian)

Ключевые слова