Аннотация
Цель — разработка ПЦР метода с флуоресцентной детекцией в реальном времени для выявления туберкулезных и нетуберкулезных микобактерий в клиническом материале, в том числе за счет выявления свободно циркулирующей ДНК в крови,
плевральной жидкости, других тканях и органах. Для выявления уникальных мутаций пригодных для дискриминации туберкулезных и нетуберкулезных микобактерий, проведен биоинформационный анализ референсных геномов микобактерий
для их выравнивания по гомологичным нуклеотидным последовательностям. Анализ выровненных последовательностей M.
tuberculosis complex, M. avium complex и других медленно и быстро растущих микобактерий, представленных в базе данных
NCBI, выявил участок гена Rv0440 (GroEl2), содержащий в позициях 529633 и 529636 специфические однонуклеотидные замены, пригодные для одностадийной ПЦР-РВ идентификации ДНК возбудителей M. tuberculosis complex и дискриминации
их от иных нетуберкулезных микобактерий. Проведено испытание разработанных компонентов ПЦР — праймеров и TaqMan
зондов на чистых культурах туберкулезных и нетуберкулезных микобактерий и клинических образцах от больных туберкулезом и микобактериозами. При разработке метода использованы образцы мокроты, крови, пунктатов лимфатических
узлов более чем 150 больных туберкулёзом и микобактериозами. Разработанные ПЦР реактивы успешно выявляли низкомолекулярную высоко-деградированную ДНК микобактерий, циркулирующую в крови и других тканях больных туберкулезом и
микобактериозами. На исчерпывающей выборке референсных геномов микобактерий из NCBI показана высокая потенциальная специфичность разработанного теста. Виртуальной программой Primer-BLAST, и вручную сервисом Blastn показано,
что разработанный метод будет успешно дискриминировать виды M. tuberculosis complex: M. tuberculosis, M. africanum, M.
canettii, M. bovis, M. caprae, M. microti от 125 видов нетуберкулезных микобактерий.
Annotation
The aim of the study is to develop a real-time PCR method with fluorescent detection for the identification and discrimination of
tuberculosis and non- tuberculosis mycobacteria in clinical material, including freely circulating DNA in blood, pleural fluid and
other tissues and organs. Bioinformatics analysis of mycobacterial genomes was performed to align them with homologous nucleotide
sequences. Aligned sequences of M. tuberculosis complex, M. avium complex and other slow and fast-growing mycobacteria
presented in the NCBI database, were analysed, it was revealed the Rv0440 (GroEl2) gene region containing specific single-nucleotide
substitutions in positions 529633 and 529636. This SNPs were suitable for design of a diagnostic test for one-step PCR of DNA
of M. tuberculosis complex and nontuberculous mycobacteria. The developed PCR reagents — primers and TaqMan probes were
tested on pure cultures of tuberculosis and nontuberculous mycobacteria and clinical samples from patients with tuberculosis and
mycobacteriosis. Sputum, blood and lymph node samples from more than 150 patients with tuberculosis and mycobacteriosis were
used in the development of the method. The developed PCR reagents successfully detected low molecular weight, highly degraded
mycobacterial DNA circulating in the blood and other tissues of patients with tuberculosis and mycobacteriosis. Exhaustive sampling
of mycobacterial reference genomes from NCBI demonstrated the high potential specificity of the developed test. Using the virtual
program Primer-BLAST, as well as manually using the Blastn service, it was shown that the developed method successfully discriminates
species of the M. tuberculosis complex: M. tuberculosis; M. africanum; M. canettii; M. bovis; M. caprae; M. microti from 125 species
of nontuberculous mycobacteria.
Key words: PCR-RT; TaqMan probes; Rv0440 gene; M. tuberculosis complex; nontuberculous mycobacteria
Список литературы
Л И Т Е Р А Т У Р А ( П П . 1 — 3 , 7 — 1 5 , 1 7 — 2 0 С М .
REFERENCES )
4. Эргешов А.Э., Шмелев Е.И., Ковалевская М.Н., Ларионова Е.Е.,
Черноусова Л.Н. Нетуберкулезные микобактерии у пациентов с
заболеваниями органов дыхания (клинико-лабораторное исследование). Пульмонология. 2016; 26(3):303-08. DOI: 10.18093/0869-
0189-2016-26-3-303-308.
5. Старкова Д. А., Журавлев В. Ю., Вязовая А. А., Соловьева Н. С.,
Куликова О. Н., Нарвская О. В. Видовое разнообразие нетуберкулезных микобактерий у больных микобактериозом на территориях
Северо-Западного федерального округа России. Туберкулёз и болезни лёгких. 2019; (6):16-22. DOI: 10.21292/2075-1230-2019-97-
6-16-22.
6. Макарова М.В., Гунтупова Л.Д. Нетуберкулезные микобактерии.
БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2020;
20(2):97-102. DOI: 10.30895/2221-996X-2020-20-2-97-102.
7. Огарков О.Б., Жданова С.Н., Орлова Е.А., Хромова П.А., Белькова
Н.Л., Синьков В.В., и др. Секвенирование 16S-ITS-23S фрагмента рибосомального оперона обеспечивает необходимые и достаточные условия для идентификации микобактерий. Инфекция и
иммунитет. 2022; 12(5):976-80. DOI: 10.15789/2220-7619-ROS1871.
16. Хромова П.А., Огарков О.Б., Жданова С.Н., Синьков В.В., Моисеева Е.Я., Цыренова Т.А., и др. Выявление высокотрансмиссивных
генотипов возбудителя в клиническом материале для прогноза неблагоприятного течения туберкулёза Клиническая лабораторная
диагностика. 2017; 62 (10): 622-7. DOI: 10.18821/0869-2084-2017-
62-10-622-627.
REFERENCES
1. Global tuberculosis report 2023. Geneva: World Health Organization; 2023. Licence: CC BY-NC-SA 3.0 IGO. https://www.who.int/
publications/i/item/9789240083851.
2. Togun T., Kampmann B., Stoker N.G., Lipman M. Anticipating the
impact of the COVID-19 pandemic on TB patients and TB control
programmes. Ann. Clin. Microbiol. Antimicrob. 2020; 19(1):21.
DOI: 10.1186/s12941-020-00363-1.
3. Koh W.J. Nontuberculous Mycobacteria-Overview. Microbiol. Spectr. 2017; 5(1). DOI: 10.1128/microbiolspec.TNMI7-0024-2016.
4. Ergeshov A.E., Shmelev E.I., Kovalevskaya M.N., Larionova
E.E., Chernousova L.N. Nontuberculous mycobacteria in patients
with respiratory diseases (a clinical study). Pul`monologiya. 2016;
26(3):303-08. DOI: 10.18093/0869-0189-2016-26-3-303-308.
5. Starkova D.A., Zhuravlev V.Yu., Vyazovaya A.A., Solovieva N.S., Kulikova O.N., Narvskaya O.V. Species diversity of non-tuberculous mycobacteria in patients with mycobacteriosis in the North-Western Federal District of Russia. Tuberkulyoz I bolezni legkikh. 2019; 97(6):16-22.
DOI: 10.21292/2075-1230-2019-97-6-16-22. (in Russian)
6. Makarova M.V., Guntupova L.D. Nontuberculous mycobacteria.
BIOpreparaty. Profilaktika, diagnostika, lechenie. 2020; 20(2):97–
102. DOI: 10.30895/2221-996X-2020-20-2-97-102. (in Russian)
7. Ogarkov O. B., Zhdanova S. N., Orlova E. A., Khromova P. A., Belkova N. L., Sinkov V.V., et al. 16S-ITS-23S rRNA operon segment
sequencing provides necessary and sufficient conditions for bacterial
species-specific identification. Infektsiya I immunitet. 2022; 12(5):
976-80. DOI: 10.15789/2220-7619-ROS-1871. (in Russian)
8. Saxena S., Spaink H.P., Forn-Cuní G. Drug Resistance in Nontuberculous Mycobacteria: Mechanisms and Models. Biology (Basel).
2021; 10(2):96. DOI: 10.3390/biology10020096.
9. Pennington K.M., Vu A., Challener D., Rivera C.G., Shweta F.N.U.,
Zeuli J.D., et al. Approach to the diagnosis and treatment of non-tuberculous mycobacterial disease. J. Clin. Tuberc. Other. Mycobact.
Dis. 2021; 24:100244. DOI: 10.1016/j.jctube.2021.100244.
10. Ogarkov O., Zhdanova S.N., Sinkov V., Khromova P.A., Orlova E.,
Heysell S. Quantitative DST determination in a patient with sepsis
from M. avium before isolation of strain. Chest. 2020; 157(S6).
DOI: 10.1016/j.chest.2020.05.075
11. Bergin S.P., Chemaly R.F., Dadwal S.S., Hill J.A., Lee Y.J., Haidar
G. et al. Plasma Microbial Cell-Free DNA Sequencing in Immunocompromised Patients With Pneumonia: A Prospective Observational Study. Clin. Infect. Dis. 2024; 78(3):775-84. DOI: 10.1093/cid/
ciad599.
12. Yang X., Che N., Duan H., Liu Z., Li K., Li H. et al. Cell-free Mycobacterium tuberculosis DNA test in pleural effusion for tuberculous
pleurisy: a diagnostic accuracy study. Clin. Microbiol. Infect. 2020;
26(8):1089.e1-89.e6. DOI: 10.1016/j.cmi.2019.11.026.
13. Li G., Cannon K., Sisniega C., Fergie J. Cell-free DNA blood test
for the diagnosis of pediatric tuberculous meningitis. J. Clin. Tuberc. Other. Mycobact. Dis. 2024; 35:100421. DOI: 10.1016/j.jctube.2024.100421.
14. Sinkov V.V., Ogarkov O.B., Plotnikov A.O., Gogoleva N.E., Zhdanova S.N., Pervanchuk V.L. et al. Metagenomic analysis of mycobacterial transrenal DNA in patients with HIV and tuberculosis
coinfection. Infect. Genet. Evol. 2020; 77:104057. DOI: 10.1016/j.
meegid.2019.104057.
15. Bachar K., Shulimzon T., Segel M.J. Nontuberculous mycobacteria
infections of the pleura: A systematic review. Respir. Med. 2022;
205:107036. DOI: 10.1016/j.rmed.2022.107036
16. Khromova P.A., Ogarkov O.B., Zhdanova S.N., Sinkov V.V., Moiseeva E.Y., Tzyrenova T.A., et al. The detection of highly-transmissible
genotypes of agent in clinical samples for prognosis of unfavorable
course of tuberculosis. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika.
2017; 62(10):622-7. DOI: 10.18821/0869-2084-2017-62-10-622-
627. (in Russian)
17. Ogarkov O., Zhdanova S., Savilov E., Mokrousov I., Sinkov V., Antipina S. ‘Lethal’ combination of Mycobacterium tuberculosis Beijing
genotype and human CD209 -336G allele in Russian male population. Infection, Genetics and Evolution. 2012; 12(4): 732-36. DOI:
10.1016/j.meegid.2011.10.005.
18. Zhou L., Ma C., Xiao T., Li M., Liu H., Zhao X., et al. A New Single
Gene Differential Biomarker for Mycobacterium tuberculosis Complex and Non-tuberculosis Mycobacteria. Front. Microbiol. 2019;
10:1887. DOI: 10.3389/fmicb.2019.01887.
19. Ustinova V.V., Smirnova T.G., Sochivko D.G., Varlamov D.A., Larionova E.E., Andreevskaya S.N. et al. New assay to diagnose and
differentiate between Mycobacterium tuberculosis complex and nontuberculous mycobacteria. Tuberculosis (Edinb). 2019; 114:17-23.
DOI: 10.1016/j.tube.2018.10.004.
20. Telenti A., Marchesi F., Balz M., Bally F., Böttger E.C., Bodmer T. Rapid identification of mycobacteria to the species level
by polymerase chain reaction and restriction en