РАЗРАБОТКА И ОЦЕНКА ДИАГНОСТИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК ИММУНОФЕРМЕНТНОГО МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИТЕЛ, БЛОКИРУЮЩИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ RBD SARS-CОV-2 И ACE2

Аннотация

Цель: изучение функциональных характеристик иммуноферментного анализа (ИФА) определения антител, блокирующих
взаимодействие RBD и ACE2 (суррогатный вируснейтрализующий анализ, sVNT).
Материал и методы. Исследовали 374 образца сывороток крови, полученных от добровольцев с известным анамнезом в
2017-2020 гг., 97 образцов, полученных в 2021 году от пациентов, переболевших и иммунизированных вакцинным препаратом
«Гам-КОВИД-Вак». Образцы сывороток крови анализировали: 1) ИФА определения антител класса IgG к RBD SARS-CoV-2;
2) в реакции биологической нейтрализации вируса SARS-CoV-2 в культуре клеток; 3) в суррогатном вируснейтрализующем
тесте.
Результаты. Параметры sVNT анализа оптимизированы на двух выборках из 397 (2017-2020 гг.) и 97 (2021 г.) образцов
добровольцев. При валидации метода оценка порогового значения, позволяющая дифференцировать образцы, содержащие
антитела, блокирующие взаимодействие RBD и ACE2, от не содержащих антител, определялась двумя статистическими
методами. ROC-методом раздельно проанализированы образцы сывороток крови добровольцев с постинфекционным и ги-
бридным иммунитетом. Во всех случаях получены близкие (31,45-31,65%) пороговые значения и высокие диагностические
характеристики. Аналитическая чувствительность, определённая путём титрования международного стандартного об-
разца First WHO International Standard for anti-SARS-CoV-2 immunoglobulin (human) в sVNT, составила 20-22 BAU/мл. При
изучении корреляционной связи между результатами sVNT и количеством IgG антител к RBD SARS-CoV-2 коэффициент
Спирмена составил 0,8979 (ДИ 95%:0,8425-0,9345, p<0,001). При определении процентной согласованности результатов,
полученных в sVNT с титром нейтрализующих антител, полученным в вирусологической реакции нейтрализации, коэффици-
ент Спирмена составил 0,8187 (ДИ 95%:0,7641-0,8616, p<0,001).
Заключение. Ключевую роль во взаимодействии вируса с клеткой человека в процессе инфицирования последней играет об-
разование распознающего комплекса между рецептор-связывающим доменом, расположенным на субъединице S1 белка Spike
SARS-CoV-2 и трансмембранным белком человека, ангиотензин-превращающим ферментом 2 типа. Поэтому иммунологи-
ческие средства определения антител, специфически блокирующие взаимодействие между RBD и ACE2, могут служить
адекватной альтернативой РБН для определения протективности приобретённого гуморального иммунитета. Был раз-
работан sVNT метод, позволяющий выявлять антитела, блокирующие взаимодействие RBD и ACE2, простым, безопасным
и быстрым способом с высокой специфичностью и чувствительностью.

Annotation

The purpose of this work was to study the functional characteristics of an enzyme immunoassay for the determination of antibodies
blocking the interaction of RBD and ACE2 (surrogate virus neutralizing analysis, sVNT).
Material and methods. 374 blood serum samples obtained from volunteers with a known medical history in 2017-2020, 97 samples
obtained in 2021 from patients who had been ill and immunized with the vaccine drug «Gam-COVID-Vaс». Blood serum samples were
analyzed: 1) enzyme immunoassay for the determination of antibodies of class G to RBD SARS-CoV-2, 2) in the neutralization reaction
of the SARS-CoV-2 virus in cell culture 3) in a surrogate virus neutralizing test.
Results. The sVNT analysis parameters were optimized on 2 samples from 397 (2017-2020) and 97 (2021) samples of volunteers. During
the validation of the method, the threshold value estimation, which makes it possible to differentiate samples containing antibodies
blocking the interaction of RBD and ACE2 from those not containing them, was determined by two statistical methods. Blood serum
samples from volunteers with postinfectious and hybrid immunity were analyzed separately using the ROC method. In all cases, close
(31.45-31.65%) threshold values and high diagnostic characteristics were obtained. The analytical sensitivity determined by titration
of the international standard sample First WHO International Standard for anti-SARS-CoV-2 immunoglobulin (human) in sVNT was
20-22 BAU/ml. When studying the correlation between sVNT results and the amount of IgG antibodies to RBD SARS-CoV-2, the Spearman
coefficient was 0.8979 (95% CI:0.8425-0.9345, p<0.001). When determining the percentage consistency of the results obtained in
sVNT with the titer of neutralizing antibodies obtained in the virological neutralization reaction, the Spearman coefficient was 0.8187
(95% CI:0.7641-0.8616, p<0.001).
Сonclusion. A critical aspect in the interaction between the virus and human cells during infection is the formation of a recognition
complex between the receptor-binding domain located on the S1 subunit of the SARS-CoV-2 Spike protein and the human angiotensinconverting
enzyme 2 transmembrane protein. Therefore, immunological tools for antibody detection that specifically block the interaction
between RBD and ACE2 could serve as an adequate substitute for virus neutralization reaction in determining the protective
capacity of acquired humoral immunity.
The sVNT method has been developed, which allows the detection of antibodies blocking the interaction of RBD and ACE2 in a simple,
safe and fast way with high specificity and sensitivity.
Key words: enzyme immunoassay; surrogate virus neutralizing analysis; RBD; SARS-CoV-2; ACE 2; virus neutralization reaction;
neutralizing antibodies

Об авторах

Список литературы

Л И Т Е РАТ У РА ( П П . 1 — 6 , 8 — 1 3 , 1 6 — 1 9
С М . R E F E R E N C E S )
7. Черепович Б.С., Кудряшова А.М., Карташова Н.П., Грачева А.В.,
Мануйлов В.А., Ленева И.А. и др. Псевдонейтрализующий
тест для доклинических исследований вакцин против SARSCoV-
2. Медицинская иммунология. 2024; 26(3):569-76. DOI:
10.15789/1563-0625-PTF-2905.
14. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология:
Основы доказательной медицины. М.: Медиа-Сфера; 1998.
15. Гланц С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ. М.:
Практика; 1998.
R E F E R E NC E S
1. Meyer B., Reimerink J., Torriani G., Brouwer F., Godeke G.J., Yerly S.
et al. Validation and clinical evaluation of a SARS-CoV-2 surrogate virus
neutralisation test (sVNT). Emerging microbes & infections. 2020;
9:2394-2403. DOI:10.1080/22221751.2020.1835448.
2. Walls A.C., Park Y.J., Tortorici M.A., Wall A., McGuire A.T., Veesler
D. Structure, function, and antigenicity of the SARS-CoV-2 spikeg.
Cell. 2020; 181:281-92.e6. DOI:10.1016/J.CELL.2020.02.058.
3. Hoffmann M., Kleine-Weber H., Schroeder S., Krüger N., Herrler T.,
Erichsen S. et al. SARS-CoV-2 cell entry depends on ACE2 and TMPRSS2
and is blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell.
2020; 181(2):271-80.e8. DOI: 10.1016/J.CELL.2020.02.052.
4. Xiaojie S., Yu L., lei Y., Guang Y., Min Q. Neutralizing antibodies
targeting SARS-CoV-2 spike protein. Stem. cell research. 2021;
50:102125. DOI:10.1016/J.SCR.2020.102125.
5. Yang Y., Du L., Carver R.J., Yang D. SARS-CoV-2 spike protein: a key
target for eliciting persistent neutralizing antibodies. Signal Transduction
and Targeted Therapy. 2021; 6(1):95. DOI: 10.1038/s41392-021-
00523-5.
6. Tan C.W., Chia W.N., Qin X., Liu P., Chen M.I., Tiu C. et al. A SARSCoV-
2 surrogate virus neutralization test based on antibody-mediated
blockage of ACE2-spike protein-protein interaction. Nature Biotechnology.
2020; 38(9):1073-8. DOI: 10.1038/s41587-020-0631-z.
7. Cherepovich B.S., Kudryashova A.M., Kartashova N.P., Gracheva
A.V., Manuilov V.A., Leneva I.A. et al. Pseudoneutralizing test for
preclinical studies of vaccines against SARS-CoV-2. Meditsinskaya
immunologiya. 2024; 26(3):569-76. DOI: 10.15789/1563-0625-PTF-
2905. (in Russian)
8. Garcia-Beltran W.F., Lam E.C., Astudillo M.G., Yang D., Miller T.E.,
Feldman J. et al. COVID-19-neutralizing antibodies predict disease severity
and survival. Cell. 2021; 184(2):476-88.e11. DOI:10.1101/202
0.10.15.20213512.
9. Bauer G. The variability of the serological response to SARS-corona
virus-2: Potential resolution of ambiguity through determination
of avidity (functional affinity). Journal of medical virology. 2021;
93(1):311-22. DOI:10.1002/JMV.26262.
10. Wajnberg A., Amanat F., Firpo A., Altman D.R., Bailey M.J., Mansour
M. et al. Robust neutralizing antibodies to SARS-CoV-2 infection
persist for months. Science. 2020; 370(6521):1227-30. DOI:10.1126/
SCIENCE.ABD7728.
11. Bertoglio F., Meier D., Langreder N., Steinke S., Rand U., Simonelli L. et
al. SARS-CoV-2 neutralizing human recombinant antibodies selected from
pre-pandemic healthy donors binding at RBD-ACE2 interface. Nature com-
munications. 2021; 12(1):1577. DOI: 10.1038/s41467-021-21609-2.
12. Mattiuzzo G., Bentley E.M., Hassall M., Routley S., Richardson S.,
Bernasconi V. et al. Establishment of the WHO International Standard
and Reference Panel for anti-SARS-CoV-2 antibody. 2020. Available
at: https://www.who.int/docs/default-source/biologicals/ecbs/bs-2020-
2403-sars-cov-2-ab-ik-17-nov-2020.pdf?sfvrsn=662b46ae_2.
13. Wilson E.B. Probable Inference, the Law of Succession, and Statistical
Inference. Journal of the American Statistical Association. 1927;
22(158): 209-12. DOI:10.1080/01621459.1927.10502953.
14. Fletcher R., Fletcher S., Wagner E. Clinical epidemiology. Fundamentals
of evidence-based medicine [Klinicheskaya epidemiologiya].
Moscow: Media-Sfera; 1998. (in Russian)
15. Glantz S. Biomedical Statistics [Biomeditsinskaya statistika]. Trans.
from Engl. Moscow: Praktika;1998. (in Russian)
16. Nie J., Li Q., Wu J., Zhao C., Hao H., Liu H. et al. Establishment and
validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2.
Emerging microbes & infections. 2020; 9(1):680-6. DOI:10.1080/222
21751.2020.1743767.
17. Mariën J., Michiels J., Heyndrickx L., Nkuba-Ndaye A., Ceulemans
A., Bartholomeeusen K. et al. Evaluation of a surrogate virus neutralization
test for high-throughput serosurveillance of SARS-CoV-2.
Journal of virological methods. 2021; 297:114228. DOI:10.1016/J.
JVIROMET.2021.114228.
18. Wang G., Yang M.L., Duan Z.L., Liu F.L., Jin L., Long C.B. et al. Dalbavancin
binds ACE2 to block its interaction with SARS-CoV-2 spike
protein and is effective in inhibiting SARS-CoV-2 infection in animal
models. Cell Research. 2021; 31(1):17-24. DOI: 10.1038/s41422-020-
00450-0.

Ключевые слова