СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ АЛГОРИТМА СЕРОТИПИРОВАНИЯ STREPTOCOCCUS PNEUMONIAE МЕТОДОМ МУЛЬТИПЛЕКСНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Аннотация

Цель работы. Усовершенствование протокола определения серотиповой принадлежности Streptococcus pneumoniae с использованием комплекса методов мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (М-ПЦР-РВ) и мультиплексной ПЦР (М-ПЦР) с электрофоретической визуализацией продуктов амплификации.
Материалы и методы. Проанализирована коллекция из 195 проб ликвора, отобранных у пациентов возрастной категории до 5 лет с клинически подтвержденным диагнозом пневмококкового менингита. Верификацию присутствия ДНК S. pneumoniae осуществляли методом ПЦР-РВ (ген-мишень lytA). Определение серотипа проводили по двухуровневому алгоритму: начальная стадия включала 7 последовательных реакций М-ПЦР-РВ, на следующей стадии использовали усовершенствованный протокол М-ПЦР с анализом результатов методом электрофореза в агарозном геле (4 этапа).
Результаты. Разработанный алгоритм позволил снизить общее количество проводимых ПЦР-реакций с 16 до 11 и сократить продолжительность анализа на 22 % (до 18 час). Серотиповая идентификация успешно проведена для 78 % (152/195) исследованных образцов ликвора. Представленная схема обеспечивает детекцию всех серотипов, включенных в состав вакцин ПКВ13 и ПКВ20.
Заключение. Модифицированный протокол серотипирования S. pneumoniae способствует оптимизации лабораторного мониторинга посредством снижения временных и трудовых затрат при сохранении высокой точности идентификации эпидемиологически значимых серотипов, что имеет ключевое значение для эффективного эпидемиологического надзора в условиях широкого применения пневмококковых вакцин.

Annotation

The aim of the study: to refine a protocol for serotype detection in Streptococcus pneumoniae by integrating multiplex real-time polymerase chain reaction (mqPCR) with conventional multiplex PCR (electrophoretic visualization).
Materials and methods: We analysed 195 cerebrospinal fluid specimens from patients under five years of age with confirmed pneumococcal meningitis. S. pneumoniae detection was performed using real-time PCR targeting lytA gene. Serotyping employed a two-tier approach: an initial stage of seven sequential mqPCR assays, followed by an optimised multiplex PCR protocol with agarose gel electrophoresis (four stages).
Results. The refined algorithm reduced the required number of PCR assays from 16 to 11 and decreased processing time by 22% (to 18 hours). Serotype identification was achieved for 78% (152/195) of cerebrospinal fluid specimens. The presented scheme detects all serotypes covered by both PCV13 and PCV20 vaccines.
Conclusion. The modified serotyping protocol for S. pneumoniae enhances laboratory surveillance efficiency by reducing processing time and labour requirements while maintaining high detection accuracy for epidemiologically relevant serotypes. This represents a significant advancement for effective epidemiological monitoring in widespread vaccination settings.
Key words: Streptococcus pneumoniae; serotyping; polymerase chain reaction; pneumococcal infection; PCV13; PCV20

Об авторах

Список литературы

ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-7, 9-10, 12-14 см. REFERENCES)
8. Минздрав зарегистрировал двадцативалентную вакцину Pfizer против пневмококковой инфекции. Фармацевтический вестник. 2025 Sept 18 [cited 2025 Nov 12]; Available from: https://pharmvestnik.ru/
11. Современные методы капсульного типирования Streptococcus pneumoniae: возможности и доступность для практической лаборатории / А. Н. Чагарян, Н. В. Иванчик, К. О. Миронов, А. А. Муравьев // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2022; 24(1): 61-6. – DOI 10.36488/cmac.2022.1.61-66

1. REFERENCES
   GBD 2019 Antimicrobial Resistance Collaborators. Global mortality associated with 33 bacterial pathogens in 2019: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2019. Lancet. 2022;400(10369):2221-48. doi:10.1016/S0140-6736(22)02185-7
   Hawkins PA, Chochua S, Lo SW, Belman S, Antonio M, Kwambana-Adams B., et al. A global genomic perspective on the multidrug-resistant Streptococcus pneumoniae 15A-CC63 sub-lineage following pneumococcal conjugate vaccine introduction. Microbial Genomics. 2023;9(4):mgen000998. doi: 10.1099/mgen.0.000998.
   Wahl B, O’brien KL, Greenbaum A, Majumder A, Liu L, Chu Y, et al. Burden of Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenzae type b disease in children in the era of conjugate vaccines: global, regional, and national estimates for 2000-15. Lancet Global Health. 2018;6(7):e744-e757. doi: 10.1016/S2214-109X(18)30247-X.4
   WHO manual 2-nd ed., Laboratory Methods for the Diagnosis of Meningitis caused by Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae and Haemophilus influenza // WHO/IVB. — 2011. — 323 p.
   Thadchanamoorthy V, Dayasiri K. Review on Pneumococcal Infection in Children. Cureus. 2021;13(5):e14913. doi: 10.7759/cureus.14913
   Van De Beek D, Brouwer MC, Koedel U, Wall EC. Community-acquired bacterial meningitis. The Lancet. 2021;398(10306):1171-83. doi: 10.1016/S0140-6736(21)00883-7.
   Lo SW, Gladstone RA, van Tonder AJ, Bentley SD, du Plessis M, von Gottberg A, et al. Pneumococcal lineages associated with serotype replacement and antibiotic resistance in childhood invasive pneumococcal disease in the post-PCV13 era: an international whole-genome sequencing study. Lancet Infectious Diseases. 2019;19(7):759-69. doi: 10.1016/S1473-3099(19)30297-X.
   Минздрав зарегистрировал двадцативалентную вакцину Pfizer против пневмококковой инфекции. Фармацевтический вестник. 2025 Sept 18 [cited 2025 Nov 12]; Available from: https://pharmvestnik.ru/content/news/Pfizer-zaregistrirovala-dvadcativalentnuu-vakcinu-protiv-pnevmokokkovoi-infekcii.html (in Russian)
   Moore CE, Sengduangphachanh A, Thaojaikong T, Sirisouk J, Foster D, Phetsouvanh R, et al. Enhanced determination of Streptococcus pneumoniae serotypes associated with invasive disease in Laos by using a real-time polymerase chain reaction serotyping assay with cerebrospinal fluid. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 2010;83(3):451-7. doi: 10.4269/ajtmh.2010.10-0225.
   Resti M, Moriondo M, Cortimiglia M, Indolfi G, Canessa C, Becciolini L, et al. ommunity‐acquired bacteremic pneumococcal pneumonia in children: diagnosis and serotyping by real‐time polymerase chain reaction using blood samples. Clinical Infectious Diseases. 2010; 51(9):1042-9. doi: 10.1086/656579.
   Chagaryan AN, Ivanchik NV, Mironov KO, Muravyev AA. Current methods of capsular typing of Streptococcus pneumoniae: possibilities and availability for local laboratories. Klinicheskaya Mikrobiologiya i Antimikrobnaya Khimioterapiya (Clinical Microbiology and Antimicrobial Chemotherapy). 2022; 24(1):61-6. DOI 10.36488/cmac.2022.1.61-66 (in Russian)
   Messmer TO, Sampson JS, Stinson A, Wong B, Carlone GM, Facklam RR. Comparison of four polymerase chain reaction assays for specificity in the identification of Streptococcus pneumoniae. Diagnostic microbiology and infectious disease 2004;49(4):249-54. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2004.04.013
   Lang ALS, McNeil SA, Hatchette TF, Elsherif M, Martin I, LeBlanc JJ. Detection and prediction of Streptococcus pneumoniae serotypes directly from nasopharyngeal swabs using PCR. Journal of Medical Microbiology. 2015;64(8):836-44. doi: 10.1099/jmm.0.000097
   Pimenta FC, Roundtree A, Soysal A, Bakir M, Du Plessis M, Wolter N, et al. Sequential Triplex Real-Time PCR Assay for Detecting 21 Pneumococcal Capsular Serotypes That Account for a High Global Disease Burden. Journal of Clinical Microbioljgy. 2013;51(2):647-52. doi: 10.1128/JCM.02927-12.

Ключевые слова