Аннотация
Цель – разработка подходов к клинической лабораторной диагностике инфекций, вызываемых некультивируемыми формами энтеробактерий и стафилококков на основе изучения закономерностей и сроков их перехода в некультивируемое состояние. Материал и методы. Изучена динамика ключевых показателей в монопопуляциях и смеси энтеробактерий (E. coli M17, S. Typhimurium 79) и S. aureus 209P, перешедших в некультивируемое состояние (НС) в условиях четырёхмесячной инкубации при трофическом и осмотическом стрессах.
Результаты. Статистически обработанные величины общего микробного числа (ОМЧ/мл) бактерий, КОЕ/мл, количества живых и мертвых клеток, процента жизнеспособных некультивируемых клеток (ЖНК) свидетельствует, что численность ЖНК зависит от индивидуальных особенностей микроорганизмов и от пролиферативной активности посевных культур. Быстрее в НС переходила S. Typhimurium 79. При высеве из консорциума бактерий наиболее эффективной при реверсии S. Typhimurium 79 и E. coli M17 из НС в активную форму была среда Эндо по сравнению со средой Плоскирева и висмут-сульфатным агаром для сальмонелл. Вероятно, что S. aureus 209P после длительного стресса в ассоциации с сальмонеллой и антагонистически активным пробиотическим штаммом E. coli M17 оказался низкоконкурентным или нереверсировавшим при высеве на неоптимальный для ЖНК стафилококка маннитол-солевой агар, поскольку рост стафилококка на нем отсутствовал уже через 7 суток стресса.
Заключение. Сведения по динамике численности ЖНК микроорганизмов имеют практическое значение для клинической лабораторной диагностике инфекций, вызываемых некультивируемыми формами энтеробактерий и стафилококков, поскольку возможно получение ложных результатов из-за ЖНК при снижении или отсутствии роста с аналитом, высеянным на неоптимальную для выхода из НС дифференциально-диагностическую питательную среду.
Annotation
The aim was to develop approaches to clinical laboratory diagnostics of infections caused by uncultivated forms of enterobacteria and staphylococci based on the study of the patterns and timing of their transition to an uncultivated state.
Material and methods. The dynamics of key parameters in monopopulations and a mixture of enterobacteria (E. coli M17 and S. Typhimurium 79) and Staphylococcus (S. aureus 209P) that became nonculturable state (NCS) under conditions of 4-month incubation under trophic and osmotic stress were studied.
Results. Statistically processed values of the total microbial count (TMC/ml) of bacteria, CFU/ml, the number of live and dead cells, the percentage of viable nonculturable cells (VBNC) indicate. that the number of VBNC depended on the individual characteristics of the microbes and the proliferative activity of the seed cultures. S. Typhimurium 79 converted to the NCS most rapidly. When seeded from a bacterial consortium, Endo medium was most effective in reverting S. Typhimurium 79 and E. coli M17 from the NCS to the active form compared to Ploskirev medium, as well as bismuth sulfate agar for Salmonella. It is likely, that S. aureus 209P after prolonged stress in association with Salmonella and the antagonistically active probiotic strain E. coli M17 turned out to be low-competitive or did not revert when seeded on mannitol salt agar, which is not optimal for Staphylococcus VBNC, since Staphylococcus growth on it was already absent after 7 days of stress.
Conclusion. Information on the dynamics of the number of VBNC microbes is of practical importance for clinical laboratory diagnosis of infections caused by uncultivated forms of enterobacteria and staphylococci, since it is possible to obtain false results due to the presence of a VBNC with a decrease or absence of growth with the studied material, which is sown on a differential diagnostic medium that is not optimal for exiting the NCS.
Key words: viable nonculturable cells; stress; enterobacteria; staphylococcus; key indicators; false results
Список литературы
ЛИТЕРАТУРА (пп. 1, 5-8, 10-14, 16-28, 30 см. REFERENCES)
2. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. М.: Медицина; 2005.
3. Соколенко А.В., Миронов А.Ю. Некультивируемые формы холерных вибрионов: парадигма функциональной дифференциации патогенных бактерий. Ростов-на-Дону, Азов: АзовПечать; 2013. IBSN 978-5-4382-0122-9.
4. Романова Ю.М., Горячев С.Н. Современный взгляд на экологию бактерий: некультивируемые формы, персисторы, биопленки. М.: АР-Консалт; 2017.
9. Абдуллаева А.М., Блинкова Л.П., Пахомов Ю.Д., Валитова Р.К. Микробиологические принципы работы с жизнеспособными некультивируемыми микроорганизмами. М.: Издательский дом «Научная библиотека»; 2023. DOI: 10.36871.978-5-907672-64-2. ISBN 978-5-907672-64-2.
15. Абдуллаева А.М., Блинкова Л.П., Уша Б.В., Валитова Р.К., Пахомов Ю.Д., Митрофанова Д.Б. Детекция жизнеспособных некультивируемых клеток микроорганизмов в курином фарше. Detection of viable non-culturable microbial cells in minced chicken. Health, Food & Biotechnology. 2019; 1(4). 26-38. DOI: 10.36107/hfb.2019.i4.s281.
29. Пахомов Ю.Д., Блинкова Л.П. Биоопасность жизнеспособных некультивируемых микроорганизмов. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2019; 96(3): 83-91.
REFERENCES
Xu H.S., Roberts N., Singleton F.L. Attwel R., Grimes D.J., Colwel R. R. Survival and viability of nonculturable Escherichia coli and Vibrio cholerae in estuarine and marine environment. Microb. Ecol. 1982; 8: 313-23.
Bukharin O.V., Gintsburg A.L., Romanova Yu.M., El’-Registan G.I. Mechanisms of bacterial survival [Mekhanizmy vyzhivaniya bakteriy]. Moscow: Meditsina; 2005. (in Russian)
Sokolenko A.V., Mironov A.Yu. Uncultivated forms of cholera vibrios: a paradigm of functional differentiation of pathogenic bacteria [Nekul’tiviruemye formy kholernykh vibrionov: paradigma funktsional’noy differentsiatsii patogennykh bakteriy]. Rostov-na-Donu, Azov: AzovPechat’; 2013. IBSN 978-5-4382-0122-0. (in Russian)
Romanova Yu.M., Goryachev S.N. Modern view on the ecology of bacteria: uncultivated forms, persisters, biofilms [Sovremennyy vzglyad na ekologiyu bakteriy: nekul’tiviruemye formy, persistory, bioplenki]. Moscow: AR-Konsalt; 2017. (in Russian)
Skorlupkina N., Blinkova L., Pakhomov Yu., Piyadina A., Chistyakova D. Formation and reversion of VBNC cells of Salmonella Typhimurium preincubated in different substrates. International Journal of Current Research and Review. 2017; 09(09), 5: 20-5. DOI: 10.7324/UCRR.2017.992025.
Mukamolova G.V., Yanopolskaya N.D., Kell D.B., Kaprelyants A.S. On resuscitation from the dormant state of Micrococcus luteus. Antonie Van Leeuwenhoek. 2018; 73: 237-43. DOI: 10.1023/A:1000881918216.
Dong K., Pan H., Yang D., Rao L., Zhao L., Wang Y., et al. Induction, detection, formation, and resuscitation of viable but non-culturable state microorganisms. Compr. Rev. Food Sci. Food Saf. 2020; 19: 149-83. DOI:10.1111/1541-4337.12513.
Zhang X.-H., Ahmad W., Zhu X.Y., Chen J., Austin B. Viable but Nonculturable bacteria and their resuscitation: Implications for cultivating uncultured marine microorganisms. Mar. LifeSci Tekhnol. 2021; 3: 189-203, doi: 10.1007/s42995-020-00041-3.
Abdullaeva A.M., Blinkova L.P., Pakhomov Yu.D., Valitova R.K. Microbiological principles of work with viable non-culturable microorganisms [Mikrobiologicheskie printsipy raboty s zhiznesposobnymi nekul’tiviruemymi mikroorganizmami]. Moscow: Izdatel’skiy dom «Nauchnaya biblioteka»; 2023. DOI: 10.36871.978-5-907672-64-2. ISBN 978-5-907672-64-2. (in Russian)
Asakura H., Makino S.-I., Takagi T Passage in mice causes a change in the ability of Salmonella enterica serovar Oranienburg to survive NaCl osmotic stress: resuscitation from the viable but non-culturable state. FEMS Microbiol. Lett. 2002; 212 (1): 87-93.
Masuda Y., Tajima K., Ezura Y. Resuscitation of Tenacibaculum sp., the causative bacterium of spotting disease of sea urchin Strongylocentroutus intermedius from viable but non–culturable state. Fisheries Science. 2004; 70(2): 277-84.
Bech-Terkilsen S., Westman I.O., Swingers J.H., Siegumfeldt H. Oenococcus oeni, a species born and moulded in wine: a critical review of the stress impacts of wine and the physiological responses. Australian Journal of Grape and Wine Research. 2020; 26: 188-206. DOI: 10.1111/ajgw.12436.
Blinkova L.P., Martirosyan D., Pakhomov Yu. D., Dmitrieva O.V., Vaughan R. Altshuler M. Nonculturable forms of bacteria in lyophilized probiotic preparations. Functional. Foods in Health and Disease. 2014; 4 (2): 66-76.
Zhao X., Zhong J., Wei C., Lin C.-W., Ding T. Current perspectives on viable but non-culturable state in foodborne pathogens. Front. Microbiol. 2017; 8(580): 1-32. DOI: 10.3389/fmicb.2017.00580.
Abdullaeva A.M., Blinkova L.P., Usha B.V., Valitova R.K., Pakhomov Yu.D., Mitrofanova D.B. Detection of viable non-culturable microbial cells in minced chicken. Health, Food & Biotechnology. 2019; 1(4): 26-38. DOI: 10.36107/hfb.2019.i4.s281. (in Russian)
Zhang J., Yang H., Li J., Hu J., Lin G., Tan B.K., Lin S. Current perspectives on viable but non-culturable foodborne pathogenic bacteria. A Review. Foods. 2023; 12: Article 1179. DOI: 10.3390/foods12061179.
Kibbee R.J., Ormeci B. Development of a sensitive and false-positive free PMA-qPCR viability assay to quantify VBNC Escherichia coli and evaluate disinfection performance in wastewater effluent. Journal of Microbiological Methods. 2017; 132: 139-47. DOI: 10.1016/j.mimet.2016.12.004.
Daranas N., Bonaterra A., Francés J., Cabrefiga J., Montesinos E., Badosa E. Monitoring viable cells of the biological control agent Lactobacillus plantarum PM411 in aereal plant surfaces by means of a strain-specific viability quantitative PCRmethod. Appl. Environ. Microbiol. 2018; 84: e00107-18. DOI: 10.1128/AEM.00107-18.
Majeed M., Majeed S., Nagabhushanam K., Punnapuzha, A., Philip S., Mundkur L. Rapid assessment of viable but non-culturable Bacillus coagulans MTCC 5856 in commercial formulations using low cytometry. PLoS ONE. 2018; 13: e0192836, DOI:10.1371/journal.pone.0192836.
Pasquaroli S., Zandri G., Vignaroli C., Vuotto C/. Donelli G/. Biavasko F. Antibiotic pressure can induce the viable but non-culturable state in Staphylococcus aureus growing in biofilms. J. Antimicrob. Chemother. 2013; 68 (8): 1812-7.
Aliver-Daza J.J., Garcia-Barco A., Osorio-Vargas P., Gutiérrez-Zapal H.M., Anabria J., Rengifo -Herrera J.A. Resistance and induction of viable but non culturable states (VBNC) during inactivation of E. coli and Klebsiella pneumoniae by addition of H2O2 to natural well water under simulated solar irradiation. Water Res. 2021; 188: Article 116499.
Xia K., Han C., Xu J., Liang X. Toxin-antitoxin HicAB regulates the formation of persister cells responsible for the acid stress resistance in Acetobacter pasteurianus. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2021; 105: 725-39. DOI: 10.1007/s00253-020-11078-w.
Chengsong Y., Chenian C., Mingbao F., Ranwen O., Xin Y. Emerging contaminants in the water environment: Disinfection-induced viable but nonculturable waterborne pathogens. Journal of Hazardous Materials. 2024; 461: Aticle 132666.
Boaretti M., Del Mar Lieo M., Bonato B., Signoretto C., Canepari P. Involment of rpoS in the survival of Escherichia coli in the viable but non-culturable state. Environ. Microbiol. 2003; 5: 986-96. DOI: 10.1046/j.1462-2920.2003.00497.x.
Asakura H., Ishiwa A., Arakawa E., Makino S., Okada Y., Yamamoto S., Igimi S. Gene expression profile of Vibrio cholerae in the cold stress induced Viable but Non-culturable (VBNC) state. Environ. Microbiol. 2007; 9: 869-79. DOI:10.1111/1462-2920.2006.01206.x.
Hung W., Jane W.N., Wong H. Association of a D-alanyle — D-alanine carboxypeptidase gene with the formation of aberrantly shaped cells during the infection of Viable but Nonculturable Vibrio parahaemolyticus. Appl. Environ. Microbiol. 2013; 79: 7305-12. DOI:10. 1128/AEM.01723-13.
Ayrapetyan M., Williams T.C., Oliver J.D. Interspecific quorum sensing mediates the resuscitation of viable but nonculturable vibrios. Appl. Environ. Microbiol. 2014; 80 (8): 2478-83.
Liu J., Li L., Li B., Peters B.M., Deng Y., Xu Z., Shirtliff M.E. Transcriptonic analyses on the formation of the viable putative non- culturable state of beer spoilage Lactobacillus acetotolerans. Sci. Rep. 2016; 6: 36753. DOI: 10.1038/srep36753.
Pakhomov Yu.D., Blinkova L.P. Biohazard of viable uncultivated microorganisms. Zhurnal mikrobiologii, epidemiologii i immunobiologii. 2019; 96(3): 83-91. (in Russian)
Fakruddin Md., Mannan K.S.B., Andrews S. Viable but nonculturable bacteria food and public health perspective. ISRN Microbiol. 2013: 703813. DOI:10.1155/2013/703813.