СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ И ЯДЕРНОЙ ФРАКЦИЙ ГОМОГЕНАТА КЛЕТОК ЛИНИИ HEPG2 И ТКАНИ ГОЛОВНОГО МОЗГА ДЛЯ БИОХИМИЧЕСКИХ АНАЛИЗОВ

Аннотация

Введение. Определение внутриклеточной локализации белка необходимо для понимания функций клетки в норме и при патологии. Существующие методы фракционирования, такие как дифференциальное центрифугирование или коммерческие наборы, часто имеют недостатки: длительность, риск повреждения органелл, перекрестную контаминацию фракций и потерю лабильных белков. В связи с этим разработка новых, быстрых и эффективных методов получения чистых ядерных и цитоплазматических фракций остается актуальной задачей.
Цель исследования – разработать быстрый, доступный и эффективный способ разделения ядерной и цитоплазматической фракций из клеток и тканей для последующего анализа белков.
Материал и методы. Исследование проводили на ткани головного мозга крыс линии Wistar и клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2. Ткань мозга гомогенизировали в охлажденном гомогенизаторе Поттера. Выделение фракций проводили по двухэтапному протоколу: сначала клетки лизировали буфером NP-40 для получения цитоплазматической фракции, а затем осадок, содержащий ядра, лизировали буфером RIPA. Качество гомогенизации оценивали с помощью микроскопии после окрашивания по Романовскому-Гимзе, а фракционирования по флуоресцентной микроскопии с DAPI и вестерн-блот анализа с маркерами фракций (ламинин B1 для ядра и глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа (ГАФДГ) для цитоплазмы).
Результаты и обсуждение. Показано, что проведенная гомогенизация позволяет получить гомогенную суспензию клеток с интактными ядрами. Флуоресцентная микроскопия подтвердила отсутствие ядерного материала в цитоплазматической фракции и сохранность ядер в ядерной фракции. Данные вестерн-блота продемонстрировали высокую специфичность фракций: в ядерной фракции детектировался только Ламинин B1, а в цитоплазматической – только ГАФДГ, что свидетельствует о минимальной перекрестной контаминации. Разработанный метод, основанный на последовательном использовании детергентов NP-40 и RIPA, является быстрым, воспроизводимым и позволяет эффективно разделять субклеточные компартменты без этапа отмывания ядер, минимизируя потери белка.
Заключение. Предложен быстрый и эффективный метод получения чистых ядерных и цитоплазматических фракций из клеточных культур и тканей. Высокая степень очистки, подтвержденная независимыми методами (вестерн-блот, флуоресцентная микроскопия с DAPI), позволяет рекомендовать данный протокол для широкого использования в лабораторной практике, в частности, для изучения транслокации белков, например, транскрипционных факторов.

Annotation

Introduction. Determining the intracellular localization of a protein is essential for understanding cellular functions under normal and pathological conditions. Existing fractionation methods, such as differential centrifugation or commercial kits, often suffer from drawbacks: they are time-consuming, carry a risk of organelle damage, cross-contamination between fractions, and loss of labile proteins. Therefore, the development of new, rapid, and efficient methods for obtaining pure nuclear and cytoplasmic fractions remains a relevant task.
Aim. To develop a rapid, accessible, and effective method for separating nuclear and cytoplasmic fractions from cells and tissues for subsequent protein analysis.
Material and methods. The study was performed on brain tissue from Wistar rats and human hepatocellular carcinoma HepG2 cells. Brain tissue was homogenized in a chilled Potter homogenizer. Fraction isolation was carried out using a two-step protocol: cells were first lysed with NP-40 buffer to obtain the cytoplasmic fraction, and then the pellet containing nuclei was lysed with RIPA buffer. The quality of homogenization was assessed by microscopy after Romanowsky-Giemsa staining, and the quality of fractionation was assessed by fluorescence microscopy with DAPI and by western blot analysis using fraction markers (Lamin B1 for the nucleus and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) for the cytoplasm).
Results and discussion. It was shown that the performed homogenization yields a homogeneous cell suspension with intact nuclei. Fluorescence microscopy confirmed the absence of nuclear material in the cytoplasmic fraction and the integrity of nuclei in the nuclear fraction. Western blot data demonstrated high specificity of the fractions: Lamin B1 was detected only in the nuclear fraction, and GAPDH only in the cytoplasmic fraction, indicating minimal cross-contamination. The developed method, based on the sequential use of NP-40 and RIPA detergents, is rapid, reproducible, and allows for effective separation of subcellular compartments without a nuclear washing step, minimizing protein loss.
Conclusion. A rapid and efficient method for obtaining pure nuclear and cytoplasmic fractions from cell cultures and tissues has been proposed. The high degree of purification, confirmed by independent methods (western blot, DAPI fluorescence microscopy), allows us to recommend this protocol for widespread use in laboratory practice, particularly for studying protein translocation, e.g., of transcription factors.

Key words: cell fractions; western blot; homogenates; centrifugation

Об авторах

Список литературы

ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-4, 6-7, 9-16, 20-22 см. REFERENCES)
5. Градинарь М.М. Нейропротекторная роль гликопротеина-Р и его функционирование при экспериментальном паркинсоническом синдроме. Дис. … канд. мед. наук. Рязань; 2024.
8. Введение в клеточную биологию: Учебник для вузов. 4-е изд., перераб. и доп. Ю.С. Ченцов. М.: ИКЦ «Академкнига»; 2004.
17. Абаленихина Ю.В., Ерохина П.Д., Сеидкулиева А.А., Завьялова О.А., Щулькин А.В., Якушева Е.Н. Внутриклеточная локализация и функция ядерного фактора эритроидного происхождения 2 (Nrf2) в условиях моделирования окислительного стресса in vitro. Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2022; 30 (3):296-304. DOI: 10.17816/PAVLOVJ105574.
18. Шабардина Л.В., Рябова Ю.В., Батенева В.А., Минигалиева И.А. Изменения митохондрий, опосредованные воздействием загрязнителей среды обитания. Российский медико-биологический вестник имени академика И.П. Павлова. 2025; 33 (2):291-302. DOI: 10.17816/PAVLOVJ626297.
19. Рубцов В.А., Парыгина М.Н., Мозговой С.И., Шиманская А.Г., Маркелова М.В., Поморгайло Е.Г. и др. ARID1A как маркер предраковых изменений слизистой оболочки желудка. Наука молодых (Eruditio Juvenium). 2025; 13(1):5-14. DOI: 10.23888/HMJ20251315-14.
REFERENCES
1. Li Y., Chen Y., Tao Y., Xu J., Chen M. RhoA protein is generally distributed in the nuclei of cancer cells. Oncol. Rep. 2010; 24(4):1005-9. DOI: 10.3892/or.2010.1005.
2. Weeks S.E., Metge B.J., Samant R.S. The nucleolus: a central response hub for the stressors that drive cancer progression. Cell Mol. Life Sci. 2019; 76(22):4511-24. DOI: 10.1007/s00018-019-03231-0.
3. Wang X., Li S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim. Biophys. Acta. 2014; 1846(1):13-25. DOI: 10.1016/j.bbcan.2014.03.006.
4. Liao P.C., Bergamini C., Fato R., Pon L.A, Pallotti F. Isolation of mitochondria from cells and tissues. Methods Cell Biol. 2020; 155:3-31. DOI: 10.1016/bs.mcb.2019.10.002.
5. Gradinar` M.M. The neuroprotective role of glycoprotein-P and its functioning in experimental Parkinson’s syndrome. Diss. … Ryazan`; 2024. (in Russian)
6. Qin Y., Zhou Y., Wang K., Gu J., Xiong Z., Zhang W. et al. In situ isolation of nuclei or nuclear proteins from adherent cells: a simple, effective method with less cytoplasmic contamination. Biol. Res. 2023; 56(1):18. DOI: 10.1186/s40659-023-00429-2.
7. Hamana K., Iwai K. Effects of triton X-100 on gel electrophoresis and gel chromatography of histones. Possible binding to helical regions. J. Biochem. 1976; 79(1):125-9. DOI: 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a131039.
8. Introduction to Cell Biology: Textbook for Universities. Yu.S. Chentsov. 4th ed., revised and expanded. Moscow: Akademkniga; 2004. (in Russian)
9. Giemsa G. Eine Vereinfachung und Vervollkommnung meiner Methylenazur-Methylenblau-Eosin-Färbemethode zur Erzielung der Romanowsky-Nochtschen Chromatinfärbung. Centralbl f Bakt etc : magazin. 1904; 37: 308-11.
10. Fan Z., Beresford P.J., Zhang D., Xu Z., Novina C.D., Yoshida A. et al. Cleaving the oxidative repair protein ape1 enhances cell death mediated by granzyme A. Nat. Immunol. 2003; 4:145-53. DOI: 10.1038/ni885.
11. Barcellona M. L., Cardiel G. and Gratton E. Time-resolved fluorescence of dapi in solution and bound to polydeoxynucleotides. Biochemical and biophysical research communications. 1990; 170 (1): 270-80.
12. Otto F. DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. Methods Cell Biol. 1990; 33:105-10. DOI: 10.1016/s0091-679x(08)60516-6.
13. Tarnowski B.I., Spinale F.G., & Nicholson, J. H. (1991). DAPI as a useful stain for nuclear quantitation. Biotechnic & Histochemistry. 1991; 66(6):296-302. DOI: 10.3109/10520299109109990.
14. Kapuscinski J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotech. Histochem. 1995; 70(5):220-33. DOI: 10.3109/10520299509108199.
15. Garvalov B.K., Muhammad S., Dobreva G. Lamin B1 in cancer and aging. Aging (Albany NY). 2019; 11(18):7336-8. DOI: 10.18632/aging.102306.
16. Galvis A.E., Fisher H.E., Camerini D. NP-40 fractionation and nucleic acid extraction in mammalian cells. Bio. Protoc. 2017; 7(20):e2584. DOI: 10.21769/BioProtoc.2584.
17. Abalenikhina Yu.V., Erokhina P.D., Seidkuliyeva A.A., Zav’yalova O.A., Shchul’kin A.V., Yakusheva E.N. Intracellular location and function of nuclear factor of erythroid origin 2 (Nrf2) in modeling oxidative stress in vitro. Rossiyskiy mediko-biologicheskiy vestnik imeni akad. I.P. Pavlova. 2022; 30 (3):296-304. DOI: 10.17816/PAVLOVJ105574. (in Russian)
18. Shabardina L.V., Ryabova Y.V., Bateneva V.A., Minigalieva I.A. Mitochondrial alterations mediated by exposure to environmental pollutants. Rossiyskiy mediko-biologicheskiy vestnik imeni akad. I.P. Pavlova. 2025; 33(2):291-302. DOI: 10.17816/PAVLOVJ626297. (in Russian)
19. Rubtsov V.A., Parygina M.N., Mozgovoy S.I., Shimanskaya A.G., Markelova M.V., Pomorgaylo E.G. et al. ARID1A as a marker of precancerous changes in the gastric mucosa. Nauka molodykh (Eruditio Juvenium). 2025; 13 (1):5-14. DOI: 10.23888/HMJ20251315-14. (in Russian)
20. Ota Y., Koizume S., Nakamura Y., Yoshihara M., Takahashi T., Sato S. et al. Tissue factor pathway inhibitor‑2 is specifically expressed in ovarian clear cell carcinoma tissues in the nucleus, cytoplasm and extracellular matrix. Oncol. Rep. 2021; 45(3):1023-32. DOI: 10.3892/or.2021.7944.
21. Chen M., Liu Z., Zheng K., Hu C., Peng P. The potential mechanism of HIF-1α and CD147 in the development of triple-negative breast cancer. Medicine (Baltimore). 2024; 103(23):e38434. DOI: 10.1097/MD.0000000000038434.
22. Liu J., Xu D., Wang H., Zhang Y., Chang Y., Zhang J. et al. The subcellular distribution and function of MTA1 in cancer differentiation. Oncotarget. 2014; 5(13):5153-64. DOI: 10.18632/oncotarget.2095.

Ключевые слова