Аннотация
Цель исследования — разработка методов лабораторной диагностики лепры на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР). Отработаны методы экстракции ДНК из различного клинического материала (биоптаты и скарификаты кожи, соскобы со слизистой поверхности носа и с трофических язв, сыворотки крови). Сконструированы системы олигонуклеотидов к 16S рРНК и зонда для идентификации Mycobacterium leprae в формате Real-time для амплификатора ДТ-96 (ООО «НПО ДНК-Технология», Россия), отработан оптимальный режим амплификации. Для контроля за ходом ПЦР вводили систему внутреннего контроля. Оценка специфичности и чувствительности тест-системы проводилась на 17 штаммах различных видов микобактерий и клинических образцах от 32 больных лепрой и 15 здоровых лиц, находящихся в семейном контакте с больными лепрой. Установлена 100% чувствительность обнаружения Mycobacterium leprae в биоптатах кожи методом ПЦР по сравнению со стандартным бактериоскопическим методом (88,9%). Во всех других клинических образцах также определялась более высокая чувствительность разработанной тест-системы на основе ПЦР. Предложенная тест-система обладает высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет решить вопрос быстрой идентификации Mycobacterium leprae, и может быть использована в эпидемиологических исследованиях при изучении распространения возбудителя заболевания.
Список литературы
Hulse E.V. Leprosy and ancient Egypt. Lancet. 1972; 2: 1024-5.
Hansen G.A. Spedalshedens Arsager. Norsk Magazin for Laedevidenskaben. 1874; 4: 76-9.
Shinnick T.M., Good R.C. Mycobacterial taxonomy. Eur. J. Clin. Microb. 1990; 13(3): 884-901.
Shepard C.C. The experimental disease that follows the infection of human leprosy bacilli into footpads of mice. J. Exp. Med. 1960; 112: 445-54.
Shepard C.C., McRae D.H. A method for counting acid-fast bacteria. Int. J. Lepr. 1968; 36: 78-82.
Ridley D.S., Jopling W.H. Classification of leprosy according to immunity. A five-group system. Int. J. Lepr. 1966; 34: 255-73.
Domínguez J., Blanco S., Lacoma A., García-Sierra N., Prat C., Ausina V. Utility of molecular biology in the microbiological diagnosis of mycobacterial infections. Enferm. Infect. Microbiol. Clin. 2008; 26(9): 33-41.
Kirchheimer W.F., Sanchez R.M. Quantitative aspects of leprosy in armadillos. Lepr. India. 1977; 49: 48-53.
Scollard D.M., Adams L.B., Gillis T.P., Krahenbuhl J.L., Truman R.W., Williams D.L. The continuing challenges of leprosy. Clin. Microbiol. Rev. 2006; 19: 338-81.
World Health Organization. Global leprosy: situation 2016-2020. 2016: 1-20.
Lamb F.I., Singh N.B., Colston M.J. The specific of 18 kDa antigen of Mycobacterium leprae is present in Mycobacterium habana and functions as a heat-shock protein. J. Immunol. 1990; 144: 1922-5.
Shinnick T.M., Vodkin M.H., Williams J.C. The Mycobacterium tuberculosis 65-kilodalton antigen is a heat shock protein which corresponds to common antigen to the Escherichia coli GroEl protein. Infect. Immun. 1988; 56: 446-51.
Mostafa H.M., Kazda M.V.D., Irgens L.M., Luesse H.G. Acid-fast bacilli from former leprosy regions in coastal Norway showing PCR positivity for Mycobacterium leprae. Int. J. Lepr. 1995; 63: 97-9.
Martinez N.A., Lahiri R., Pittman L.T., Scollard D., Truman R., Moraes M.O. et al. Determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 2009; 47: 2124-30.
Sharma R., Lavania M., Katoch K., Chauhan D.S., Gupta A.K., Gupta U.D. et al. Development and evalution of real-time RT-PCR asaay for quantitative estimation of viable mycobacterium leprae in clinical samples. Indian J. Lepr. 2008; 80: 315-21.
Santos A.R., Balassiano V., Oliveira M.L., Pereira M.A., Santos P.B., Degrave W.M. et al. Detection of Mycobacterium leprae DNA by polymerase chain reaction in the blood of individuals, eight years after completion of anti-leprosy therapy. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 2001; 96: 1129-33.
Ebenezer G.J., Daniel S., Norman G., Daniel E., Job C.K. Are viable Mycobacterium leprae present in lepromatous patients after completion of 12 months and 24 months multi-drug therapy? Indian J. Lepr. 2004; 76(3): 199-206.
Martinez A.N., Ribeiro-Alves M., Sarno E.N., Moraes M.O., Ozcel M.A. Evaluation of qPCR-based assays for leprosy diagnosis directly in clinical specimens. PLoS Negl. Trop. Dis. 2011; 5: e1354.
Turrene C.Y., Tschetter L., Wolfe J., Kabani A. Necessity of Quality-controlled 16S rRNA gene sequence databases: identifying nontuberculous Mycobacterium species. Clin. Microbiol. 2001; 39: 3637-48.
Cox R.A., Kempsell K., Fairclongh L., Corston M.S. The 16S ribosomal RNA of Mycobacterium leprae contains unique sequence, which can be used for identification by the polymerase chain reaction. J. Med. Microbiol. 1991; 35: 284-90.
De Wit M.Y.L., Klatser P.R. Mycobacterium leprae isolates from different sources have identical sequences of the spacer region between the 16S and 23S ribosomal RNA genes. Microbiology. 1994; 140: 1982-7.
Dobner P., Feldmann K., Rifai M., Löscher T. Rapid identification of mycobacterial species by PCR amplification of hypervariable 16S rRNA gene promoter regions. J. Clin. Microbiol. 1996; 34: 806-9.
Haile Y., Ryon J.J. Colorimetric microtitre plate hybridization assay for the detection of Mycobacterium leprae 16S rRNA in clinical specimens. Lepr. Rev. 2004; 75: 40-9.
Rampini S.K., Bloemberg G.V., Keller P.M., Büchler A.C., Dollenmaier G., Speck R.F. et al. Broad-range 16S rRNA gene polymerase chain reaction for diagnosis of culture-negative bacterial infections. J. Infect. Dis. 2011; 53: 1245-51.