Аннотация
Выявление соматических мутаций в гене CALR регламентировано клиническими рекомендациями для диагностики эссенциальной тромбоцитемии и первичного миелофиброза. Выявление мутаций CALR обычно проводят трудоёмкими методами, требующими специальных навыков работы и дорогостоящего оборудования. Цель работы — сравнение результатов выявления мутаций гена CALR в пробах венозной крови методами аллель-специфической полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с последующим электрофорезом, фрагментным анализом и секвенированием по Сэнгеру и методом пиросеквенирования. Исследованы 1284 образца крови пациентов с подозрением на хронические миелопролиферативные новообразования и 20 образцов крови доноров. Мутации в гене CALR I и II типа определяли с помощью аллель-специфической ПЦР-РВ, используя оригинальные праймеры и TaqMan-зонды. Редкие варианты мутаций CALR определяли с помощью электрофоретической детекции. Все положительные образцы были в дальнейшем исследованы методами фрагментного анализа и секвенирования по Сэнгеру, а также разработанным методом пиросеквенирования с использованием прибора PyroMarkQ24. Использование аллель-специфической ПЦР с последующей электрофоретической детекцией позволило определить наличие клинически значимых мутаций в гене CALR в 81 образце венозной крови JAK2- и MPL-негативных пациентов, в том числе 42 случая мутации I типа, 33 — II типа и 8 редких мутаций CALR. Ни в одном из 20 образцов доноров крови и 121 образца крови пациентов с истинной полицитемией мутаций в 9-ом экзоне CALR не было выявлено. В 20 отрицательных образцах мутации CALR также не были обнаружены и при использовании секвенирования по Сэнгеру. Все положительные образцы подтверждены фрагментным анализом и секвенированием. Описанный сочетанный подход выявления мутаций гена CALR в образцах периферической крови может использоваться в лабораториях, имеющих стандартный комплект оборудования для ПЦР-РВ и электрофореза нуклеиновых кислот. В качестве подтверждающего теста предложен метод пиросеквенирования с использованием системы генетического анализа PyroMarkQ24.
Об авторах
Ольховский Игорь АлексеевичКрасноярский филиал ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава РФ, 660036, Красноярск, Россия; ФГБНУ Федеральный исследовательский центр «Красноярский научный Центр Сибирского отделения РАН», 660036, Красноярск, Россия; канд. мед. наук, дир. Красноярского филиала ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр гематологии» Минздрава РФ; e-mail: krashemcenter@mail.ru
Список литературы
Абдулкадыров К.М., Шуваев В.А., Мартынкевич В.С. Миелопролиферативные новообразования. М.: Литтерра; 2016
Klampfl T., Gisslinger H., Harutyunyan A.S., Nivarthi H., Rumi E., Milosevic J.D., et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. N. Engl. J. Med. 2013; 369(25): 2379-90.
Nangalia J., Massie C.E., Baxter E.J., Nice F.L., Gundem G., Wedge D.C., et al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. N. Engl. J. Med. 2013; 369(25): 2391-405.
Arber DA, Orazi A, Hasserjian R, Thiele J, Borowitz MJ, Le Beau MM et al. The 2016 revision to the World Health Organization classification of myeloid neoplasms and acute leukemia. Blood. 2016; 127(20): 2391-405.
Меликян А.Л., Туркина А.Г., Ковригина А.М., Суборцева И.Н., Судариков А.Б., Соколова М.А. и др. Клинические рекомендации по диагностике и терапии Ph-негативных миелопролиферативных заболеваний (истинная полицитемия, эссенциальная тромбоцитемия, первичный миелофиброз) (ред. 2016 г.). Гематология и трансфузиология. 2017; 62(S1): 25-60
Shivarov V., Ivanova M., Tiu R.V. Mutated calreticulin retains structurally disordered C terminus that cannot bind Ca2+: some mechanistic and therapeutic implications. Blood Cancer J. 2014; 4(2): e185.
Stanley R.F., Steidl U. Molecular Mechanism of Mutant CALR-Mediated Transformation. Cancer Discov. 2016; 6(4): 344-6.
Imai M., Araki M., Komatsu N. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms. Int. J. Hematol. 2017; 105(6): 743-7.
Rotunno G., Mannarelli C., Guglielmelli P., Pacilli A., Pancrazzi A., Pieri L. et al. Impact of calreticulin mutations on clinical and hematological phenotype and outcome in essential thrombocythemia. Blood. 2014; 123(10): 1552-5.
Rumi E., Pietra D., Ferretti V., Klampfl T., Harutyunyan A.S., Milosevic J.D. et al. JAK2 or CALR mutation status defines subtypes of essential thrombocythemia with substantially different clinical course and outcomes. Blood. 2014; 123(10):1544-51.
Cassinat B., Verger E., Kiladjian J.J. Interferon alfa therapy in CALR-mutated essential thrombocythemia. N. Engl. J. Med. 2014; 371: 188-9.
Gardner J.A., Peterson J.D., Turner S.A., Soares B.L. Lancor C.R., Dos Santos L.L. et al. Detection of CALR Mutation in Clonal and Nonclonal Hematologic Diseases Using Fragment Analysis and Next-Generation Sequencing. Am. J. Clin. Pathol. 2016; 146(4): 448-55.
Миронов К.О., Дунаева Е.А., Дрибноходова О.П., Шипулин Г.А. Опыт использования систем генетического анализа на основе технологии пиросеквенирования. Справочник заведующего КДЛ. 2016; 5: 33-42.
Доступно по: https://www.qiagen.com/no/shop/new-products/real-time-pcr/ipsogen-calr-rgq-pcr-kit-ce/#resources Ссылка активна на 20.03.2018.
Горбенко А.С., Столяр М.А., Ольховский И.А. Разработка молекулярно-генетического теста выявления мутаций в гене кальретикулина (CALR). Клиническая лабораторная диагностика. 2014; 59(9):29.
Ольховский И.А., Горбенко А.С., Столяр М.А., Субботина Т.Н., Васильев Е.В., Виноградова Е.Ю. и др. Определение мутации в гене кальретикулина у пациентов с подозрением на хронические миелопролиферативные неоплазии. Гематология и трансфузиология. 2014; 59(3): 12-5.
Ольховский И.А., Горбенко А.С., Субботина Т.Н., Столяр М.А. Современные возможности молекулярно-генетического анализа в диагностике хронических миелоидных опухолей. Медицинский алфавит. Современная лаборатория. 2015;4(18):44-6.