АНАЛИЗ СПЕЦИФИЧНОСТИ ПРАЙМЕРОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ VIBRIO CHOLERAE МЕТОДОМ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ ПЕТЛЕВОЙ АМПЛИФИКАЦИИ (LAMP) IN SILICO И IN VITRO

Аннотация

Представлены результаты идентификации штаммов холерных вибрионов и определения их патогенности методом изотермической петлевой амплификации (LAMP) с использованием сконструированных оригинальных праймеров. Оптимизированы временные и температурные условия анализа (650 С в течениe 30-60 мин). Чувствительность составила 1×104 м.кл./мл. Не обнаружено перекрёстных реакций с ДНК представителей других близкородственных видов и родов. Разработанные праймеры для LAMP являются точным и ценным инструментом для выявления V. cholerae, в том числе, продуцирующих холерный токсин. Этот анализ может заменить трудоёмкие биохимические тесты для идентификации V. cholerae.

Об авторах

Список литературы

1. Shuvalova E. P., Belozerov E. S., Belyaeva T. V., Zmushko E. I. Infectious diseases [Infektsionnye bolezni]. St.Petersburg: SpetsLit; 2016. (in Russian)
2. Xu M., Fu H., Chen D., Shao Z., Zhu J., Alali W. et al. Simple Visualized Detection Method of Virulence-Associated Genes of Vibrio cholerae by Loop-Mediated Isothermal Amplification.
Frontiers in Microbiology. 2019; 10: 2899. DOI: 10.3389/ fmicb.2019.02899.
3. Zago V., Zambon M., Civettini M., Zaltum O., Manfrin A. Virulence-associated factors in Vibrio cholerae non-O1/non-O139 and V. mimicus strains isolated in ornamental fish species. J. Fish Dis.ь2017; 40: 1857-68. DOI: 10.1111/jfd.12659.
4. Casasola-Rodriguez B., Ruiz-Palacios G. M., Pilar R. C., Losano L., Ignacio M., Velásquez M. Detection of VBNC Vibrio cholerae by RTreal time PCR based on differential gene expression analysis. FEMS Microbiol. Lett. 2018; 365(15): fny156. DOI: 10.1093/femsle/fny156.
5. Bwire G., Debes A.K., Orach C.G., Kagirita A., Ram M., Komakech H. et al. Environmental surveillance of Vibrio cholerae O1/ O139 in the five African great lakes and other major surface water sources in Uganda. Front. Microbiol. 2018; 9: 1560. DOI: 10.3389/fmicb.2018.01560.
6. Nandi B., Nandy R.K., Mukhopadhyay S., Nair G. B., Shimada T., Ghose A.C. et al. Rapid method for species-specific identification of Vibrio cholerae using primers targeted to the gene of outer membrane protein OmpW. J. Clin. Microbiol. 2000; 38: 4145-51. DOI: 10.1128/JCM.38.11.4145-4151.2000.
7. Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa Т., Watanabe К., Amino N. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000; 28(12): E63. DOI: 10.1093/nar/28.12.e63.
8. Parida M., Sannarangaiah S., Dash P.K., Rao P.V.L., Morita K. Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP): A New Generation of Innovative Gene Amplification Technique; Perspectives in Clinical Diagnosis of Infectious Diseases. Reviews in Medical Virology. 2008; 18 (6): 407-21. DOI: 10.1002/rmv.593.
9. Nagamine K., Hase T., Notomi T. Accelerated reaction by loopmediated isothermal amplification using loop primers. Mol. Cell. 2002; 16: 223-9. DOI: 10.1006/mcpr.2002.0415.
10. Ke X.M., Chen Y.Y., Gao L.L., Du Z., Feng X., Liao R. et al. Establishment and application of a loop-mediated isothermal amplifcation method for rapid diagnosis of Vibrio cholerae. Nan. Fang. Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2009; 29(10): 2059-63. PMID: 19799145.
11. Okada K., Chantaroj S., Taniguchi T., Suzuki Y., Roobthaisong A., Puiprom O. et al. A rapid, simple, and sensitive loop-mediated isothermal amplification method to detect toxigenic Vibrio cholerae in rectal swab samples. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2010; 66(2): 135-9. DOI: 10.1016/j.diagmicrobio. 2009.09.004.
12. Yamazaki W., Seto K., Taguchi M., Ishibashi М., Inoue К. Sensitive and rapid detection of choleraе toxin-producing Vibrio cholerae using a loop-mediated isothermal amplification. BMC Microbiol. 2008; 8: 94. DOI: 10.1186/1471-2180-8-94.
13. Gil F., Ipinza F., Fuente J., Fumeron R., Villarreal J. M., Aspеe A. et al. The ompW (porin) gene mediates methyl viologen (paraquat) efflux in Salmonella enterica serovar typhimurium. RES. Microbiol. 2007; 158: 529-36. DOI: 10.1016/j.resmic.2007.05.004.
14. Srisuk C., Chaivisuthangkura P., Rukpratanporn S., Longyant S., Sridulyakul P., Sithigorngul P. Rapid and sensitive detection of Vibrio cholerae by loop-mediated isothermal amplification targeted to the gene of outer membrane protein ompW. Lett Appl. Microbiol. 2010; 50(1): 36-42. DOI: 10.1111/j.1472-765X.2009.02749.x.
15. Lalitha P., Siti Suraiya M.N., Lim K.L., Lee S.Y., Haslindawaty A.R., Chan Y. Y. et al. Analysis of lolB gene sequence and its use in the development of a PCR assay for the detection of Vibrio cholerae. J. Microbiol. Methods. 2008; 75(1):142-4. DOI: 10.1016/j. mimet.2008.05.001.

Ключевые слова