CКРИНИНГ СОМАТИЧЕСКИХ МУТАЦИЙ В ГЕНАХ JAK2 И CALR МЕТОДОМ АНАЛИЗА КРИВЫХ ПЛАВЛЕНИЯ С ВЫСОКИМ РАЗРЕШЕНИЕМ

Аннотация

Ассоциированные с онкологическими заболеваниями, в том числе с Ph-миелопролиферативными новообразованиями (Ph-МПН), соматические мутации очень разнообразны, встречаются с разной частотой и разным уровнем аллельной нагрузки. Поэтому, на начальном этапе выполнения молекулярно-генетических диагностических процедур желательно иметь возможность проведения в лаборатории скрининговых тестов. Это особенно важно, когда проводится анализ редких и разнообразных мутаций. В ряде работ для анализа Ph-МПН-ассоциированных мутаций в генах JAK2 и CALR предлагается анализ кривых плавления с высоким разрешением (HRM-анализ, high resolution melting), который имеет высокую чувствительность и подходит для скрининга всех типов мутаций. В большинстве просмотренных нами литературных источниках авторы для анализа соматических мутаций используют амплификаторы «LightCycler» (Roche) и гораздо реже амплификатор «CFX96» (Bio-Rad), который в свою очередь чаще представлен в Российских научно-практических и медицинских организациях.
Цель работы – скрининг соматических мутаций в генах JAK2 и CALR методом HRM-анализа при использовании амплификатора «CFX96» и программы «Precision Melt Analysis» (Bio-Rad, США) для пациентов с диагнозом Ph-МПН.
В настоящем исследовании HRM-анализ проводился на образцах ДНК от пациентов с мутациями в гене JAK2 или в гене CALR. Программа «Precision Melt Analysis» выявила все варианты анализируемых мутаций, как однонуклеотидной замены в гене JAK2 (с уровнем аллельной нагрузки в диапазоне 5-40%), так и разнообразных indel мутаций в гене CALR
(с уровнем аллельной нагрузки в диапазоне 40-50%).
Таким образом, HRM-анализ, выполненный на приборе «CFX96» позволяет проводить скрининг высокоспецифичных для диагноза Ph-МПН мутаций в 14 экзоне гена JAK2 и в 9 экзоне гена CALR. Включение данного скринингового исследования в алгоритм лабораторного тестирования позволяет повысить эффективность и доступность молекулярно-генетических технологий при диагностике Ph-МПН.

Об авторах

Список литературы

Меликян А.Л., Суборцева И.Н. Биология миелопролиферативных новообразований. Клиническая онкогематология. Фундаментальные исследования и клиническая практика. 2016; 9(3): 314-25

Campbell P.J., Scott L.M., Buck G., Wheatley K., Eastetal C.L., Marsden J.T. et al. Definition of subtypes of essential thrombocythaemia and relation to polycythaemia vera based on JAK2 V617F mutation status: aprospective study. Lancet. 2005; 366(9501): 1945-53. https://doi.org/10.1016/S0140-6736(05)67785-9

Klampfl T., Gisslinger H., Harutyunyan A.S., Nivarthi H., Rumi E., Milosevic J.D. et al. Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferatie neoplasms. The new England journal of medicine. 2013; 369(25): 2379-89. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1311347

Nangalia J., Massie C.E., Baxter E.J. Nice F.L., Gundem G., Wedge D.C. et.al. Somatic CALR Mutations in Myeloproliferative Neoplasms with Nonmutated JAK2. N. Engl. J. Med. 2013; 369(25): 2391-2405. https://doi.org/10.1056/NEJMoa1312542

Barbui T., Thiele J., Gisslinger H., Kvasnicka H.M., Vannucchi A.M., Guglielmelli P. et al. The 2016 WHO classification and diagnostic criteria for myeloproliferative neoplasms: document summary and in-depth discussion. Blood Cancer J. 2018; 8(2): 15. https://doi.org/10.1038/s41408-018-0054-y

Меликян А.Л., Ковригина А.М., Суборцева И.Н., Шуваев В. А., Афанасьев Б. В., Агееваи Т. А. и др. Национальные клинические рекомендации по диагностике и терапии Ph-негативных миелопролиферативных заболеваний (истинная полицитемия, эссенциальная тромбоцитемия, первичный миелофиброз) (редакция 2018 г.). Гематология и трансфузиология. 2018; 63(3): 275-315

Levine R.L., Wadleigh M., Coolsetal J., Ebert B.L., Wernig G., Huntly B.J. et al. Activating mutation in the tyrosinekinase JAK2 in polycythemia vera, essential thrombocythemia, and myeloid metaplasia with myelofibrosis. Cancer Cell. 2005; 7(4): 387-97.

Nangalia J., Massie C.E., Baxter E.J., Nice F.L., Gundem G., Wedge D.C. et.al. Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2. American Journal of Hematology. 2014; 89(8): 2392-2405.

Merlinsky T.R., Levine R.L., Pronier E. Unfolding the Role of Calreticulin in Myeloproliferative Neoplasm Pathogenesis. Clinical Cancer Research. 2018; 18: 3777. https://doi.org/10.1158/1078-0432.CCR-18-3777

Didone A, Nardinelli L, Marchiani M, Ruiz A., de Lima Costa A. L., Lima I.S. et al. Comparative study of different methodologies to detect the JAK2 V617F mutation in chronic BCR-ABL1 negative myeloproliferative neoplasms. Pract. Lab. Med. 2015; 4: 30-7. https://doi.org/10.1016/j.plabm.2015.12.004

Jones A.V., Ward D., Lyon M., Leung W., Callaway A., Chase A. et al. Evaluation of methods to detect CALR mutations in myeloproliferative neoplasms. LeukRes. 2015; 39(1): 82-7. https://doi.org/10.1016/j.leukres.2014.11.019

Luo W, Zhongxin Yu Z. Calreticulin (CALR) mutation in myeloproliferative neoplasms (MPNs). Stem. Cell Investig. 2015; 2(16). https://doi.org/10.3978/j.issn.2306-9759.2015.08.01

Ono A. Okuhashi Y., Takahashi Y., Takahashi Y., Itoh M., Nara N., Tohda S. Advantages of the quenching probe method over other PCR-based methods for detection of the JAK2 V617F mutation. Oncol Lett. 2012; 4(2): 205-8. https://doi.org/10.3892/ol.2012.741

Rapado I., Grande S., Albizua E., Ayala R., Hernández J.A., Gallardo M. et al. High resolution melting analysis for JAK2 Exon 14 and Exon 12 mutations: a diagnostic tool for myeloproliferative neoplasms. J. Mol. Diagn. 2009; 11(2): 155-61. https://doi.org/10.2353/jmoldx.2009.080110

Moradabadi A., Farsinejad A., Khansarinejad B., Fatemi A. Development of a high resolution melting analysis assay for rapid identification of JAK2 V617F missense mutation and its validation. Exp. Hematol. Oncol. 2019; 8(10). https://doi.org/10.1186/s40164-019-0134-0

Bilbao-Sieyro C., Santana G., Moreno M., Torres L., Santana-Lopez G., Rodriguez-Medina C. et al. High resolution melting analysis: a rapid and accurate method to detect CALR mutations. PLoS One. 2014; 9(7): e103511. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0103511

Lim K., Lin H., Chen C., Wang W., Chang Y., Chiang Y. et al. Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis. International journal of clinical chemistry. 2015; 440: 133-9. https://doi.org/10.1016/j.cca.2014.11.011

Дунаева Е.А., Миронов К.О., Дрибноходова О.П. Субботина Т. Н., Башмакова Е.Е., Ольховский И.А. и др. Количественное определение мутации V617F в гене JAK2 методом пиросеквенирования. Клиническая лабораторная диагностика; 2014; 59(11): 60-3

Larsen T.S., Christensen J.H., Hasselbalch H.C. Pallisgaard N. The JAK2 V617F mutation involves B- and T-lymPhocyte lineages in a subgroup of patients with Philadelphia-chromosome negative chronic myeloproliferative disorders. Br. J. Haematol. 2007; 136(5): 745-51. https://doi.org/10.1111/j.1365-2141.2007.06497.x

Rozovski U., Verstovsek S., Manshouri T., Dembitz V., Bozinovic K., Newberry K., et al. An accurate, simple prognostic model consisting of age, JAK2, CALR, and MPL mutation status for patients with primary myelofibrosis. Haematologica. 2017; 102(1): 79-84. https://doi.org/10.3324/haematol.2016.149765

Subbotina T., Karnyushka A., Dunaeva E., Mironov K., Vasiyliev E., Mikhalev M. et al. Application of heteroduplex analysis for CARL mutation detection. HemaSphere. 2019; 3(S1): 1002-3.

Миронов К. О., Дунаева Е. А., Дрибноходова О. П., Шипулин Г. А. Опыт использования систем генетического анализа на основе технологии пиросеквенирования. Справочник заведующего КДЛ. 2016; 5: 33-43.

Субботина Т.Н., Харсекина А.Е., Дунаева Е.А., Миронов К.О., Васильев Е.В., Михалёв М.А. и др. Использование гетеродуплексного анализа и пиросеквенирования в алгоритме диагностики истинной полицитемии, ассоциированной с соматическими мутациями в 12 экзоне гена JAK2. Лабораторная служба. 2017; 6(1): 29-33. https://doi.org/10.17116/labs20176129-33

Precision Melt Analysis™ Software Instruction Manual, Available at: https://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10000080911.pdf (accessed 27 January 2020).

Sean T., Scott R., Kurtz R., Fisher C., Patel. V., Bizouam F. A Practical Guide to High Resolution Melt Analysis Genotyping. Bio-Rad Laboratories, Available at: https://www.helicon.ru/news/hrm_analiz_vse_o_metode_v_udobnoy_metodichke/ (accessed 26 January 2020).

Ключевые слова