Аннотация
Применение ферментов совместно с антибиотиками представляет перспективное направление терапии различных инфекционных заболеваний, ассоциированных с биоплёнкой, в том числе и при хроническом остеомиелите. Цель работы: повысить чувствительность бактерий Staphylococcus spp. к ципрофлоксацину, используя трипсин для разрушения матрикса биоплёнки. Биоплёнки бактерий Staphylococcus spp. (n=23) выращивали в лунках полистироловых планшетов и на поверхности покровных стекол. Эксперимент состоял из 4-х серий. В первой (контрольной) серии получали 72-часовую биоплёнку исследуемых клинических штаммов. Во второй и третьей сериях на 48- часовые биоплёнки воздействовали трипсином и ципрофлоксацином в концентрации 2 мкг/мл, в четвёртой — одновременно трипсином и ципрфлоксацином в равных соотношениях. Определяли интенсивность биоплёнкообразования на иммуноферментном анализаторе и изучали морфологию биоплёнок с помощью светового микроскопа. Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программы Gnumeric 1.12.17. В контрольной серии эксперимента практически вся поверхность покровного стекла была покрыта плёнкой. После обработки ципрофлоксацином, матрикс биоплёнки становился более разреженным, при воздействии трипсином — рыхлым. Сочетанное действие трипсином и ципрофлоксацином вело к частичной деградациии биоплёнки, рассеиванию и уменьшению площади её матрикса. Ципрофлоксацин не ингибировал биоплёнкообразование клиническими изолятами S. aureus, но бактериостатически действовал на рост биоплёнок, образованных штаммами S. haemolyticus и S. epidermidis по сравнению с контролем. Трипсин не оказывал ингибирующего действия на S. haemolyticus, но снижал ативность биоплёнкообразования штаммами S. aureus и S. epidermidis. Результатом совместного действия ципрофлоксацина и трипсина стало снижение интенсивности биоплёнкообразования всех исследуемых штаммов стафилококков в 1,5-2,2 раза. Эффективность комбинированной терапии против биоплёночных форм бактерий в хронических ранах не изучена. Применение ферментов, разрушающих межклеточный матрикс биоплёнки, способствует переходу микроорганизмов в состояние планктонных форм, что повышает эффективность проводимой антибиотикотерапии и может позволить снизить сроки санации хронических ран.
Annotation
The use of enzymes together with antibiotics is a promising direction in the treatment of various infectious diseases associated with biofilm, including chronic osteomyeliti. To increase the sensitivity of bacteria Staphylococcus sp. to ciprofloxacin, using trypsin to destroy the biofilm matrix. Biofilms of bacteria Staphylococcus spр. (n=23) were grown in the wells of polystyrene plates and on the surface of coverslips. The experiment consisted of 4 series. In the first (control) series, a 72-hour biofilm of the studied clinical strains was obtained. In the second and third series, 48-hour biofilms were exposed to trypsin and ciprofloxacin at a concentration of 2 μg/ml; in the fourth series, they were simultaneously treated with trypsin and ciprofloxacin in equal proportions. The intensity of biofilm formation was determined on an enzyme immunoassay analyzer and the biofilm morphology was studied using a light microscope. Statistical analysis of the obtained data was carried out using the Gnumeric 1.12.17 program. In the control series of the experiment, almost the entire surface of the coverslip was covered with a film. After treatment with ciprofloxacin, the biofilm matrix became sparser, and when exposed to trypsin, it became loose. The combined action of trypsin and ciprofloxacin led to partial degradation of the biofilm, dispersion and reduction in the area of its matrix. Ciprofloxacin did not inhibit biofilm formation by clinical isolates of S. aureus, but had a bacteriostatic effect on the growth of biofilms formed by strains of S. haemolyticus and S. epidermidis compared to the control. Trypsin had no inhibitory effect on S. haemolyticus, but at the same time reduced the activity
Список литературы
1. Shipitsyna I.V., Osipova E.V. Monitoring of the leading gram-positive microflora and its antibiotic sensitivity in patients with chronic osteomyelitis over a three-year period. Geniy ortopedii. 2022; 28(2): 189-93. DOI: 10.18019/1028-4427-2022-28-2-189-193. (in Russian)
2. Mironov S.P., Tsiskarashvili A.V., Gorbatyuk D.S. Chronic post-traumatic osteomyelitis as a problem of modern traumatology and orthopedics (literature review). Geniy ortopedii. 2019; 25(4): 610-21. (in Russian)
3. Burnashov S.I., Shipitsyna I.V., Osipova E.V. Microflora of surgical wounds and fistulas in patients with chronic osteomyelitis of the tibia before reconstructive treatment, in case of recurrence of infection. Klinicheskaya laboratornaya diagnostika. 2019; 64 (10): 627-31. (in Russian)
4. Okulich V.K., Kabanova A.A., Senkovich S.A., Plotnikov F.V. Antibiotic resistance of hospital isolates of Staphylococcus aureus forming a biofilm. Zdravookhraneniye (Minsk). 2015; 7: 11-6. (in Russian)
5. Kornienko M.A., Kopyltsov V.N., Shevlyagina N.V. Didenko L.V., Lyubasovskaya L.A., Priputnevich T.V. et al. The ability of Staphylococci of various species to form biofilms and their effect on human cells. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2016; 34(1): 18-25. (in Russian)
6. Shlepotina N.M., Plotkin L.L., Belov V.V. Microbiological and clinical significance of biofilm infections (literature review). Ginekologiya. 2014; 4(118): 106-12. (in Russian)
7. Schilcher K., Horswill A.R. Staphylococcal Biofilm Development: Structure, Regulation, and Treatment Strategies. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2020 Aug 12; 84(3): e00026-19. DOI: 10.1128/MMBR.00026-19.
8. Savilov E.D., Anganova E.V., Noskova O.A., Dukhanina A.V. Bacteria biofilms in purulent-septic infections. Acta biomedica scientifica. 2019; 4(5): 38-42. DOI: 10.29413/ABS.2019-4.5.6. (in Russian)
9. Sukhina M.A., Kalashnikova I.A., Kashnikov V.N., Veselov A.V., Mikhalevskaya V.I., Piyadina A.Yu. Effect of antibacterial agents on biofilm growth of clinical isolates. Koloproktologiya. 2018; 2(64): 78-84. (in Russian)
10. Chebotar` I.V., Mayansky A.N., Konchakova E.D., Lazareva AV., Chistyakova V.P., Lazareva A.V., Chistyakova V.P. Antibiotic resistance of biofilm bacteria. Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya khimioterapiya. 2012; 14(1): 51-8. (in Russian)
11. Stepanova T.V., Romanova Yu.M., Alekseeva N.V., Navolnev S.O., Navolneva O.S., Gintsburg A.L. Development of biofilm control agents: study of the effect of polysaccharide lyases on the matrix of biofilms formed by Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cenocepacia. Meditsinskiy alfavit. 2010; 1(2): 47-51. (in Russian)
12. Terent’eva N. A., Timchenko N. F., Balabanova L. A., Golotin V.A., Belik A.A., Bakunina I.Yu. et al. Influence of enzymes on the formation of bacterial biofilms. Zdorov’ye. Meditsinskaya ekologiya. Nauka. 2015; l. 60(2): 86-94. (in Russian)
13. Thallinger B., Prasetyo E.N., Nyanhongo G.S. Antimicrobial enzymes: an emerging strategy to fight microbes and microbial biofilms. Biotechnol. J. 2013; 8: 97-109.
14. Trizna E.Yu., Baidamshina D.R., Kholyavka M.G., Sharafutdinov I.S., Khairutdinova A.R., Khafizova F.A. et al. Soluble and immobilized papain and trypsin-destructors of bacterial biofilms. Geny i kletki. 2015; 10(3): 106-12. (in Russian)
15. CLSI. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-second information supplement. CLSI document M100-S22. Wayne P.A. Clinical and Laboratory Standards Institute; 2012.
16. Shipitsyna I.V., Osipova E.V., Rozova L.V. Adhesive ability of
RUSSIAN CLINICAL LABORATORY DIAGNOSTICS. 2022; 68(7)
https://doi.org/10.51620/0869-2084-2023-68-7-412-417
MICROBIOLOGY clinical strains of Enterobacter cloacae isolated from wounds of patients with chronic osteomyelitis and their sensitivity to antimicrobial drugs. Novosti khirurgii. 2017; 25(3): 273-8. (in Russian)
17. Gabidova A.E., Galynkin V.A. The main beginnings of the emergence of resistance in the biosphere. Mezhdunarodnyy zhurnal prikladnykh i fundamental’nykh issledovaniy. 2017; 3(1): 92-102. URL: https://applied-research.ru/ru/article/view?id=11407. (in Russian)
18. Afinogenova A.G., Darovskaya E.N. Microbial biofilms of wounds: state of the art. Travmatologiya I ortopediya Rossii. 2011; 3:119-25. (in Russian)
19. Kovalishena O.V., Alebashina L.A., Saperkin N.V. Resistance of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus to disinfectants: a systematic review. Zhurnal MediAl’. 2014; 3(13): 72-7. (in Russian)
20. Tets G.V., Artemenko N.K., Yankovsky G.M., Kever L.V., Komissarchik Ya.Yu., Tets V.V. The effect of the antimicrobial drug «Multicide» on Staphylococcus biofilms. Byulleten’ eksperimental’noy biologii i meditsiny. 2017; 163(6): 746-50. (in Russian)
21. Fanaei Pirlar R., Emaneini M., Beigverdi R., Banar M.B., van Leeuwen W., Jabalameli F. Combinatorial effects of antibiotics and enzymes against dual-species Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa biofilms in the woundlike medium. PLoS ONE. 2020; 15(6): e0235093. DOI: 10.1371/journal.pone.0235093.
22. Zhou J., Meng X.H., Han Q.C., Huang Y.X., Huo L.J., Lei Y.Y. An in vitro study on the degradation of multispecies biofilm of periodontitis-related microorganisms by bovine trypsin. Front. Microbiol. 2022; 13:951291. DOI: 10.3389/fmicb.2022.951291.
23. Waryah C.B., Wells K., Ulluwishewa D., Chen-Tan N., Gogoi-Tiwari J., Ravensdale J. et al. In vitro antimicrobial efficacy of tobramycin against Staphylococcus aureus biofilms in combination with or without DNase I and/or dispersin B: a preliminary investigation. Microbial. Drug. Resistance. 2017; 23(3): 384-90. DOI: 10.1089/mdr.2016.0100 PMID: 27754780.
24. Weiland-Bräuer N., Kisch M.J., Pinnow N., Liese A., Schmitz R.A. Highly effective inhibition of biofilm formation by the first metagenome-derived AI-2 quenching enzyme. Front Microbiol. 2016; 7:1098. DOI: 10.3389/fmicb.2016.01098.