ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ В КАЧЕСТВЕ КОНТРОЛЬНЫХ ОБРАЗЦОВ ПРИ ОЦЕНКЕ НАБОРОВ РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОПАСНЫХ И ОСОБО ОПАСНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ МЕТОДОМ ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИИ-ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

Аннотация

Метод обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) занимает ведущее место в диагностике заболеваний, вызванных РНК-содержащими вирусами. К выполнению всех этапов анализа (выделение нуклеиновой кислоты, проведение обратной транскрипции, амплификации ДНК) указанным методом предъявляются строгие требования. Необходимо учитывать возможность получения ложноположительных или ложноотрицательных результатов. Использования при постановке ОТ-ПЦР только положительного и отрицательного контрольного образца (ПКО и ОКО) недостаточно для контроля стадии выделения РНК и обратной транскрипции. В связи с этим существует необходимость разработки внутреннего контрольного образца (ВКО), позволяющего контролировать указанные стадии. Целью данной работы является обоснование использования генно-инженерных конструкций (ГИК) в качестве контрольных образцов (ПКО и ВКО) при оценке наборов реагентов для выявления РНК возбудителей опасных и особо опасных вирусных инфекций методом ОТ-ПЦР. В качестве ПКО использовали векторные рекомбинантные плазмиды, содержащие вставку кДНК геномной РНК возбудителя, в качестве ВКО — РНК, упакованную в белок оболочки бактериофага MS2. Показано, что ВКО не оказывает влияния на аналитическую чувствительность ОТ-ПЦР при работе как с нативными возбудителями, так с синтетическими нуклеиновыми кислотами вирусов Эбола, Марбург, Ласса, Мачупо, ВЭЛ, ЛДР, бешенства. Обсуждается возможность использования контрольных образцов при стандартизации диагностических наборов реагентов.

Об авторах

Список литературы

Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа; 1990.

Медведева Т.В., Скворцова Р.Г., Кузьменко В.В., Огарков О.Б. ПЦР-анализ в клинической лаборатории. Учебное пособие. Иркутск: РИО ИГИУВа; 2009.

Сизикова Т.Е., Мельникова Е.В., Маношкин А.В., Петров А.А., Мельников Д.Г., Пантюхов В.Б. и др. Использование внешних и внутренних контрольных образцов при постановке полимеразной цепной реакции и обратной транскрипции полимеразной цепной реакции. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 3: 41-4.

Зорина В.В. Основы полимеразной цепной реакции (ПЦР). Методическое пособие. М.: ООО «ДНК-Технология»; 2012.

Инструкция по применению набора pGEM®-T и pGEM®-T Easy Vector Systems, part # TM042, Promega (США).

Wei B., Wei Y., Zhang K., Yang C., Wang J., Xu R. et al. Construction of armored RNA containing long-size chimeric RNA by increasing the number and affinity of the pac site in exogenous rna and sequence coding coat protein of the MS2 bacteriophage. Intervirology. 2008; 51(2): 144-50.

Yu X.F., Pan J.C., Ye R., Xiang H.Q., Kou Y., Huang Z.C. Preparation of armored RNA as a control for multiplex real-time reverse transcription-PCR detection of influenza virus and severe acute respiratory syndrome coronavirus. J. Clin. Microbiol. 2008; 46(3): 837-41.

Ключевые слова