Научно-практический журнал Клиническая лабораторная диагностика

МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ГЕПАТИТА В В ПЛАЗМЕ КРОВИ ПРИ НИЗКОЙ ВИРУСНОЙ НАГРУЗКЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ

Останкова Юлия Владимировна

ISSN: 0869-2084 (Print) ISSN: 2412-1320 (Online)

Купить
Аннотация Об авторах Список литературы Ключ. слова

Аннотация

Разработан метод выявления ДНК ВГВ в периферической крови при низкой вирусной нагрузке с помощью ПЦР в режиме реального времени и оценена его значимость при идентификации HBsAg-негативного вирусного гепатита В. При разработке метода использованы образцы плазмы крови и биопсийного материала ткани печени 128 больных, проживающих на территории Санкт-Петербурга, в различных регионах РФ, а также в странах Средней Азии. Использованы также образцы плазмы крови от 96 беременных женщин и 37 пациентов гемодиализного центра, проживающих в СЗФО, 199 иностранных граждан, проходящих медицинское освидетельствование для получения разрешений на работу в Управлении по вопросам миграции в СЗФО, 397 условно-здоровых лиц, проживающих в Социалистической Республике Вьетнам. ВГВ выявляли методом «гнездовой» ПЦР. Аналитическую чувствительность проверяли методом поэтапного разведения. Согласно разработанному нами методу, на первом этапе проводится амплификация ДНК ВГВ с использованием на первом этапе олигонуклеотидов, фланкирующих участок генома 2932-3182…1-1846 нт., а на втором этапе двух пар олигонуклеотидов к двум регионам (ген S и ген X) генома вируса и соответствующих олигонуклеотидных флуоресцентно меченых зондов, комплементарных участкам амплифицируемых фрагментов, несущих на 5’-конце флуорофоры, а на 3’-конце не флуоресцентные тушители. По каналу, соответствующему флуорофору FAM, детектируется продукт амплификации ДНК ВГВ S-региона, а по каналу, соответствующему флуорофору ROX, детектируется продукт амплификации ДНК ВГВ X-региона. Чувствительность метода при экстракции ДНК из 100 мкл плазмы составила 10 МЕ/мл, получение порогового цикла Ct только по одному флуорофору FAM или ROX может свидетельствовать о наличии ДНК ВГВ в образце в нагрузке менее 10 МЕ/мл, выявление ВГВ при этом возможно при повторном ПЦР-исследовании соответствующего образца с экстракцией ДНК ВГВ из увеличенного объема плазмы (200-1000 мкл). Разработанный метод позволяет идентифицировать различные геноварианты ВГВ как характерные, так и редко встречающиеся на территории РФ, циркулирующие в других регионах мира. Метод может быть использован для выявления ВГВ в группах риска, в популяции, а также при скринировании доноров крови в целях обеспечения безопасности гемотрансфузий.