МОДИФИКАЦИЯ ИЗОТЕРМИЧЕСКОГО ТЕСТА ВЫЯВЛЕНИЯ ДНК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КЛЕЩЕВОГО БОРРЕЛИОЗА

Аннотация

Ранняя диагностика клещевого боррелиоза определяет показания для этиотропной терапии, а выявление боррелий в присосавшемся клеще служит обоснованием проведения антибиотикопрофилактики. Для определения возбудителя боррелиоза наиболее широко используются методы ПЦР, что требует особых условий организации работы лабораторий, использование дорогостоящего оборудования. Процедура выделения ДНК бактерий и последующая амплификация занимает несколько часов рабочего времени. Описаны методы детекции боррелий в изотермической реакции LAMP, что позволяет существенно ускорить диагностику, не требует сложного оборудования и высокой квалификации персонала. LAMP в ряде случаев позволяет выполнять анализ без предварительной экстракции нуклеиновых кислот. Цель работы: разработка модифицированного теста изотермической детекции ДНК возбудителей боррелиоза для ускоренного получения результата с возможностью исключения стадии экстракции нуклеиновых кислот. Использованы 40 образцов ДНК боррелий и 11 клещей Ixodes persulcatus. С целью сокращения времени детекции боррелий описанную ранее методику LAMP модифицировали введением дополнительных петлевых праймеров. Оценку количества копий в позитивном образце плазмидной ДНК боррелий определяли с помощью цифровой ПЦР. Результаты реакции LAMP сравнивали с результатами коммерческого теста ПЦР-РВ. Дополнительное использование петлевых праймеров примерно вдвое сократило время детекции ДНК боррелий, не оказывая влияния на сравнительную диагностическую эффективность. Предел аналитической чувствительности модифицированного метода LAMP равен 21 молекуле добавленного в реакцию плазмидного стандарта. В сравнительном тестировании с помощью ПЦР-РВ чувствительность метода LAMP составила 90%, специфичность 100%. Впервые продемонстрирована возможность детекции боррелий в клещах без этапа экстракции ДНК. Разработан модифицированный изотермический метод детекции возбудителей клещевого боррелиоза, позволяющий выполнять анализ в течение 20-30 минут, в том числе в клещах без предварительной экстракции ДНК.

Об авторах

Список литературы

Лобзин Ю.В., Усков А.Н., Козлов С.С. Лайм-боррелиоз (иксодовые клещевые боррелиозы). Санкт-Петербург: Фолиант; 2000.

Оберт А.С., Дроздов В.Н., Рудакова С.А. Иксодовые клещевые боррелиозы: Нозогеографические и медико-экологические аспекты. Новосибирск: Наука; 2001.

Рудакова С.А., Пеньевская Н.А., Рудаков Н.В., Пакскина Н.Д., Савельев Д.А., Блох А.И. Интенсивность и тенденции развития эпидемического процесса иксодовых клещевых боррелиозов в Российской Федерации в 2002-2018 гг. и прогноз на 2019 г. Проблемы особо опасных инфекций. 2019; (2): 22-9.

О состоянии санитарно-эпидемиологического благополучия населения в Российской Федерации в 2019 году: Государственный доклад. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, 2020. Доступно по ссылке: https://www.rospotrebnadzor.ru/documents/details.php?ELEMENT_ID=14933

Schutzer S.E., Body B.A., Boyle J., Branson B.M., Dattwyler R.J., Fikrig E. et al. Direct Diagnostic Tests for Lyme Disease. Clinical Infectious Diseases. 2019; 68(6): 1052-7.

Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000; 28(12): E63. https://doi.org/10.1093/nar/28.12.e63

Ushikubo H. Principle of LAMP method — a simple and rapid gene amplification method. Uirusu. 2004; 54(1): 107-12. https://doi.org/10.2222/jsv.54.107

Kaneko H., Kawana T., Fukushima E., Suzutani T. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. J. Biochem. Biophys. Methods. 2007; 70(3): 499-501. https://doi.org/10.1016/j.jbbm.2006.08.008

Yang J., Guan G., Niu Q., Liu Z., Li Y., Liu J. et al. Development and application of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Borrelia burgdorferi s. l. in ticks. Transbound Emerg. Dis. 2013; 60(3): 238-44. https://doi.org/10.1111/j.1865-1682.2012.01335.x

Zhang L.L., Hou X.X., Geng Z., Lou Y.L., Wan K.L., Hao Q.Combination of Loop-Mediated Isothermal Ampli cation Assay and Nested PCR for Detection of Borrelia burgdorferi sensu lato in Human Serum Samples. Biomed. Environ. Sci. 2015; 28(4): 312-5. https://doi.org/10.3967/bes2015.044

Ключевые слова