Аннотация
Адениновые нуклеотиды (АТФ, АДФ, АМФ) играют центральную роль в регуляции обмена веществ и энергии: обеспечивают энергетический баланс клетки, определяют её окислительно-восстановительное состояние, действуют как аллостерические эффекторы ряда ферментов, модулируют сигнальные и транскрипционные факторы, активируют субстраты окисления или биосинтеза. Для определения уровня АТФ, АДФ, АМФ разработано большое количество методов, но наиболее универсальным и эффективным методом разделения и анализа сложных смесей является метод обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ). Цель исследования — определение оптимальных условий для качественного разделения и количественного определения стандартных растворов АТФ (1 ммоль/л), АДФ (0,5 ммоль/л), АМФ (0,1 ммоль/л) методом ОФ ВЭЖХ. Степень разделения адениновых нуклеотидов оценивали по времени выхода пиков на хроматограмме. Для достижения цели поставлены следующие задачи: оценить влияние температуры проведения анализа на разделение и изменение времени выхода анализируемых веществ на хроматограмме; определить оптимальный состав подвижной фазы на разделение АТФ, АДФ, АМФ на хроматограмме (содержание органического растворителя в растворе); выявить влияние рН подвижной фазы на разделение стандартных растворов адениновых нуклеотидов; установить оптимальную молярность подвижной фазы для разделения АТФ, АДФ, АМФ на хроматограмме. Установлено, что температура проведения анализа не влияет на качество разделения пиков, тогда как состав и рН подвижной фазы оказывает значительное влияние на полное и чёткое разделение исследуемых нуклеотидов на хроматограмме. Оптимальными для разделения пиков адениловых нуклеотидов являются температура проведения анализа 37о С и подвижная фаза 0,05 М KH2PO4 (рН 6,0).
Список литературы
Xiaorong Fu, Stanislaw Deja, Blanka Kucejova, Joao A.G. Duarte, Jeffrey Glen McDonald, and Shawn C. Burgess. Targeted determination of tissue energy status by LC-MS/MS. Anal. Chem. 2019; 91(9): 5881-7.
Khlyntseva S. V., Bazel’ Ya. R., Vishnikin A. B., Andruch V. Methods for the determination of Adenosine Triphosphate and other Adenine Nucleotides. Journal of Analytical Chemistry. 2009; 64(7): 657-73.
Abraham E. H., Salikhova A. Y., Eugen B. Hug. Critical ATP parameters associated with blood and mammalian cells: Relevant measurement techniques. Drug development research. 2003; 59(1): 152-60.
Ozer N., Aksoy Y., Ogus I.H. New sample preparation method for the capillary electrophoretic determination of adenylate energy charge in human erythrocytes. J. Biochem. Biophys. Methods. 2000; 45: 141-6.
Karatzaferi C., De Haan A., Offringa C., Sargeant A.J. Improved high-performance liquid chromatographic assay for the determination of «high-energy» phosphates in mammalian skeletal muscle. Application to a single — fibre study in man. J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 1999; 730(2): 183-91.
Zagrebelnyi S.N., Pupkova V.I., Khripin Yu.L. Methods for the separation and quantitative determination of nucleotides, nucleosides, and bases. Usp. Khim. 1988; 57(11): 1913-32.
Хацаюк А. С., Павлова О. Е., Эхова М. Э. Роль и значение высокоэффективной жидкостной хроматографии в практике высокотехнологичных лабораторных исследований. Здоровье. Медицинская Экология. Наука. 2016; 3(66): 215-9
Zakaria M., Brown P.R. Investigation of clinical methodology for sample collection and processing prior to the reversed-phase liquid chromatographic determination of UV -absorbing plasma constituents. Anal. Biochem. 1982; 120: 25-37.
Teldcanat K.K., Fox I.H. Isocratic separation of ATP and its degradation products from biological fluids by automated liquid chromatography. Clin. Chem. 1988; 34(5): 925-32.
Jackson E.K., Ohnishi A. Development and application of a simple microassay for Adenosine in rat plasma. Hypertension. 1987; 10: 189-97.
Pérez-Milicua M.B., Zenteno-Savín T., Crocker D.E., Gallo-Reynoso J.P. Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase and inosine 5’-monophosphate dehydrogenase activities in three mammalian species: Aquatic (Mirounga angustirostris), semi- aquatic (Lontra longicaudis annectens) and terrestrial (Sus scrofa). Front. Physiol. 2015; 6(212): 1-7.
Shengming Sun, Zhongbao Gu, Hongtuo Fu, Jian Zhu, Xianping Ge and Xugan Wu. Hypoxia Induces changes in AMP — Activated Protein Kinase activity and energy metabolism in muscle tissue of the oriental river prawn Macrobrachium nipponense. Front. Physiol. 2018; 9(751): 1-13.
Garcia-Tardon N., Guigas B. Determination of adenine nucleotide concentrations in cells and tissues by high-performance liquid chromatography. Chapter in Methods in molecular biology. 2018; 1732: 229-37.
Brown P.R., Parks R.E. Jun. and Herod J. Use of high-pressure liquid chromatography for monitoring nucleotide concentration in human blood: a preliminary study with stored blood cell suspensions. Clin. Chem. 1973; 19(8): 919-22.
Pereira R.S., Bertoncheli C.M., Adefegha S.A., Castilhos L.G., Silveira K.L., Rezer J.F.P., Doleski P.H., Abdalla F.H., Santos K.F., Leal C.A.M., Santos R.C.V., Casali E.A., Moritz C.E.J., Stainki D.R., Leal D.B.R. Sepsis induced by cecal ligation and perforation (CLP) alters nucleotidase activities in platelets of rats. Microb. Pathog.2017; 111: 345-51.
Sikk P., Käämbre T., Vija H., Tepp K., Tiivel T., Nutt A., and Saks V.A. Ultra performance liquid chromatography analysis of adenine nucleotides and creatine derivatives for kinetic studies. Proceedings of the Estonian Academy of Sciences. 2009; 58(2): 122-31.
Ozkok E., Yorulmaz H., Ates G., Aksu A., Balkis N., Şahin Ö., Tamer S. Amelioration of energy metabolism by Melatonin in skeletal muscle of rats with LPS induced Endotoxemia. Physiol. Res. 2016; 65(5): 833-42.
Moritz C.E.J., Teixeira B.C., Rockenbach L., Reischak-Oliveira A., Casali E.A., Battastini A.M.O. Altered extracellular ATP, ADP and AMP hydrolysis in blood serum of sedentary individuals after an acute, aerobic, moderate exercise session. Mol. Cell. Biochem. 2017; 426: 55-63.
Doná F., Conceição I. M., Ulrich H., Ribeiro E.B., Freitas T.A., Nencioni A.L.A., da Silva Fernandes M.J. Variations of ATP and its metabolites in the hippocampus of rats subjected to pilocarpine — induced temporal lobe epilepsy. Purinergic Signalling. 2016; 12: 295-302.