ОПРЕДЕЛЕНИЕ НИЖНИХ ГРАНИЦ НОРМЫ ДЛЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ TREC И KREC У НОВОРОЖДЕННЫХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ НАБОРА РЕАГЕНТОВ «TREC/KREC-AMP PS»

Аннотация

Дефекты созревания, функциональной активности, количественная недостаточность или полное отсутствие Т- и В-лимфоцитов приводят к развитию иммунодефицитов, затрагивающих как клеточный, так и гуморальный иммунный ответ. Тяжесть таких заболеваний может сильно варьировать от бессимптомных форм до тяжёлых жизнеугрожающих состояний. Из-за ранней остановки дифференцировки предшественников лимфоцитов нередко наблюдается одновременно дефицит Т- и В-клеток. Уровни эксцизионных колец TREC и KREC признаны оптимальными суррогатными маркёрами, отражающими количество зрелых наивных T- и B-лимфоцитов, соответственно. Снижение уровней молекул TREC и/или KREC в периферической крови может служить прогностическим маркёром не только для ряда первичных, но и для приобретённых вторичных иммунодефицитов, ряда других заболеваний. Определены пороговые уровни количественного содержания фрагментов ДНК TREC и KREC в периферической крови среди новорожденных Санкт-Петербурга согласно рекомендациям Международной федерации клинической химии и Государственного стандарта (ГОСТ) Р 53022.3-2008.
Анализ уровней эксцизионных колец TREC и KREC в крови проводили с использованием разработанного диагностического набора. «TREC/KREC-AMP PS» («НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера», Санкт-Петербург), наборов «EnLite™ TREC-KREC kit» (PerkinElmer, Финляндия) и «ИММУНО-БИТ» («АБВ-Тест», Москва). Установленная нижняя граница уровня молекул TREC у новорожденных составила 892,6 копий/105 клеток и KREC — 400,4 копий/105 клеток. Сравнение уровней TREC и KREC у здоровых новорожденных и детей с диагнозом Первичный иммунодефицит позволило установить снижение содержания целевых молекул в крови больных детей. При сравнении количественного содержания молекул TREC и KREC, вычисленного с использованием реагентов разных производителей, статистически значимых различий не выявлено. Установленные пороговые границы уровней REC и KREC у новорожденных, будут способствовать эффективной персонифицированной клинической лабораторной диагностике иммунодефицитных состояний различного генеза.

Annotation

A significant proportion of primary immunodeficiencies (PIDs) are diseases characterized by a deficiency or absence of T- and/or B-lymphocytes. Such diseases often take severe life-threatening forms. T cell defects lead to combined immunodeficiencies affecting both cellular and humoral immune responses. Deficiency of mature functioning B-cells leads to insufficiency of humoral immunity. Due to the early arrest of lymphocytes precursors differentiation, there is often a simultaneous deficiency of T- and B-cells. Excision ring levels TREC and KREC are recognized as optimal surrogate markers reflecting the number of mature naive T- and B-lymphocytes, respectively. A decrease in the levels of TREC and/or KREC molecules in the peripheral blood can serve as a prognostic marker not only for a number of PIDs, but also for secondary immunodeficiencies, as well as some other diseases. The aim of the work was to determine the reference limits for quantitative analysis of TREC and KREC DNA fragments in peripheral blood among newborns in St. Petersburg using the developed diagnostic kit.
The material was 2100 dry blood spot samples obtained from healthy full-term newborns on the 3rd-4th day of life, and 157 newborn cord blood samples. As an additional control, dry blood spot samples obtained from 10 newborns with PID were used. The analysis was carried out using a set of reagents for the quantitative determination of excision rings TREC and KREC «TREC/KREC-AMP PS». The reference limits were determined by the direct method according to the recommendations of the International Federation of Clinical Chemistry and the State Standard Р 53022.3-2008.
Results. The levels of TREC and KREC molecules in each blood sample were determined in terms of 105 cells. There were no significant differences between the obtained numerical results for the two indicated samples (dry blood drop and umbilical cord blood) (p>0.05). In this connection, the groups were combined and the same reference limits of TREC and KREC molecules in whole blood and dry blood drops of newborns were determined. The established lower limit of the TREC molecules level in newborns was 892.6 copies/105 cells and KREC — 400.4 copies/105 cells. A high level of the results correlation obtained using different diagnostic kits to identify the amount of TREC and KREC is shown.
The results obtained, which made it possible to determine the reference limits of the TREC and KREC levels in newborns, will contribute to an effective personalized laboratory diagnosis of various origins immunodeficiency states.
Key words: TREC; KREC; Excision circles; Real-time PCR; Primary immunodeficiencies; newborns.

Об авторах

Список литературы

1.Amaya-Uribe L., Rojas M., Azizi G., Anaya J.M., Gershwin M.E. Primary immunodeficiency and autoimmunity: A comprehensive review. J. Autoimmun. 2019; 99: 52-72. DOI: 10.1016/j. jaut.2019.01.011.
2.Gathmann B. The European internet-based patient and research database for primary immunodeficiencies: update 2011. Clin. Exp. Immunol. 2012; 167(3): 479-91. DOI: 10.1111/j.1365-2249.2011.04542.x.
3.Sottini A., Serana F., Bertoli D., Chiarini M., Valotti M., Vaglio Tessitore M., et al. Simultaneous quantification of T-cell receptor excision circles (TRECs) and K-deleting recombination excision circles (KRECs) by real-time PCR. J. Vis. Exp. 2014; 94: 52184. DOI: 10.3791/52184.
4.Pido-Lopez J., Imami N., Aspinall R. Both age and gender affect thymic output: more recent thymic migrants in females than males as they age. Clin. Exp. Immunol. 2001; 125(3): 409-13. DOI: 10.1046/j.1365-2249.2001.01640.x.
5.Quinti I., Soresina A., Spadaro G., Martino S., Donnanno S., Agostini C., et al. Long-term follow-up and outcome of a large cohort of patients with common variable immunodeficiency. J. Clin. Immunol. 2007; 27(3): 308-16. DOI: 10.1007/s10875-007-9075-1.
6.Lucas M., Lee M., Lortan J., Lopez-Granados E., Misbah S., Chapel H. Infection outcomes in patients with common variable immunodeficiency disorders: relationship to immunoglobulin therapy over 22 years. Allergy Clin. Immunol. 2010; 125(6): 1354-60. DOI: 10.1016/j.jaci.2010.02.040.
7.Pai S.Y., Logan B.R., Griffith L.M., Buckley R.H., Parrott R.E., Dvorak C.C., et al. Transplantation outcomes for severe combined immunodeficiency, 2000–2009. N. Engl. J. Med. 2014; 371(5):434-46. DOI: 10.1056/NEJMoa1401177.
8.van Zelm M.C., van der Burg M., Langerak A.W., van Dongen J.J. PID comes full circle: applications of V(D)J recombination excision circles in research, diagnostics and newborn screening of primary immunodeficiency disorders. Front Immunol. 2011; 2:12. DOI: 10.3389/fimmu.2011.00012.
9.Yarilin A.A. Immunology [Immunologiya]. Moscow: GEOTAR-Media; 2010. (in Russian)
10.Verbsky J.W. Newborn screening for severe combined immunodeficiency; The wisconsin experience (2008-2011). J. Clin. Immunol. 2012; 1 (32): 82-8. DOI: 10.1007/s10875-011-9609-4.
11.King J.R., Hammarström L. Newborn Screening for Primary Immunodeficiency Diseases: History, Current and Future Practice. J. Clin. Immunol. 2018; 38(1):56-66. DOI: 10.1007/s10875-017-0455-x.
12.Saitgalina M.A., Ostankova Yu.V., Liubimova N.E., Semenov A.V., Kuznetsova R.N., Totolian A.A. Modified quantitative approach for assessing peripheral blood TREC and KREC levels in immunodeficient patients. Infektsiya I immunitet. 2022; 12(5): 981-96. DOI: 10.15789/2220-7619-MMF-2039. (in Russian)
13.Evgina S.A., Saveliev L.I. Current theory and practice of reference interval. Laboratornaya sluzhba. 2019; 8(2):36‑44. DOI: 10.17116/labs2019802136. (in Russian)
14.Boyd J.C. Defining, Establishing, and Verifying Reference Intervals in the Clinical Laboratory; Approved Guidelines, CLSI document C28-A3. CLSI. 2010; 28(3).
15.Jones G., Haeckel R., Loh T., Sikaris K., Streichert T., Katayev A., et al. Indirect methods for reference interval determination — review and recommendations. Clin. Chem. Lab. Med. 2018; 57(1): 20-9. DOI: 10.1515/cclm-2018-0073.
16.Saitgalina M.A., Liubimova N.E., Ostankova Yu.V., Kuznetzova R.N., Totolian A.A. Determination of reference values for TREC and KREC in circulating blood of the persons over 18 years. Meditsinskaya immunologiya. 2022; 24(6):1227-36. DOI: 10.15789/1563-0625-DOR-2587. (in Russian)
17.Verstegen R.H., Borte S., Bok L.A., van Zwieten P.H., von Döbeln U., Hammarström L., et al. Impact of Down syndrome on the performance of neonatal screening assays for severe primary immunodeficiency diseases. J. Allergy Clin. Immunol. 2014; 133:1208-11. DOI: 10.1016/j.jaci.2013.10.010.
18.Di Renzo M., Pasqui A.L., Auteri A. Common variable immunodeficiency: a review. Clin. Exp. Med. 2004; 3(4):211-7. DOI: 10.1007/s10238-004-0027-2.

Ключевые слова