ОПТИМИЗАЦИЯ ПРОТОКОЛА ОБРАБОТКИ ПРЕПАРАТОВ ЭЯКУЛЯТА ДЛЯ ПОСЛЕДУЮЩЕГО МОЛЕКУЛЯРНО-ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Аннотация

Одной из причин спонтанного прерывания беременности, бесплодия, рождения детей с нарушениями и пороками развития являются хромосомные аномалии (ХА), а также спонтанные анеуплоидии в гаметах у фенотипически нормальных родителей. Зачастую супружеские пары с репродуктивными проблемами, а также супруги, один из которых является носителем ХА, прибегают к использованию программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) для преимплантационной оценки хромосомного статуса зигот. Зачастую для оценки уровня спонтанной анеуплоидии в рамках программ ВРТ проводят исследование родительских гамет. Как правило, наиболее доступным для анализа материалом являются клетки эякулята. Для исследования полученных из эякулята препаратов гамет мужчин, используют метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). Однако такой FISH-анализ сопряжен с рядом ограничений и трудностей из-за особенностей строения головки сперматозоидов, а именно сверхконденсированного состояния хроматина хромосом. Для повышения качества анализа и эффективности гибридизации необходимо проводить предгибридизационную обработку препаратов. С целью оптимизации протокола FISH были использованы пять различных протоколов предгибридизационной обработки препаратов эякулята, полученного от девяти фенотипически нормальных мужчин. В результате проведенного сравнительного анализа эффективности гибридизации показано, что наиболее эффективным для последующего молекулярно-цитогенетического исследования является протокол с использованием трис(2-карбоксиэтил)фосфингидрохлорида (TCEP) в качестве деконденсирующего агента. Разработанный гибридный протокол, сочетающий протеолитическую предобработку, длительное инкубирование в растворе 2xSSC, TCEP и тепловую деконденсацию может быть использован в случаях, когда другие протоколы предгибридизационной обработки препаратов эякулята не эффективны.

Об авторах

Список литературы

Dohle G.R., Colpi G.M., Hargreave T.B., Papp G.K., Jungwirth A., Weidner W. EAU guidelines on male infertility. Eur. Urol. 2015; 48(5): 703-11. https://doi.org/10.1016/j.eururo.2005.06.002

Anton E., Vidal F., Blanco J. Role of sperm FISH studies in the genetic reproductive advice of structural reorganization carriers. Human Reproduction. 2007; 22(8). 2088-92. https://doi.org/10.1093/humrep/dem152

Borght M.V., Wyns C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 2018; 62:2-10. https://doi.org/10.1016/j.clinbiochem.2018.03.012

Rowe P.J., Comhaire F.H., Hargreave T.B., Mellows H.J. WHO manual for the standardised investigation and diagnosis of the infertile couple. Cambridge University Press; 1993.

Mau-Holzmann U.A. Somatic chromosomal abnormalities in infertile men and women. Cytogenet. Genome Res. 2005; 111:317-336. https://doi.org/10.1159/000086906

Donker R.B., Vloeberghs V., Groen H., Tournaye H., C.M.A. van Ravenswaaij-Arts, Land J.A. Chromosomal abnormalities in 1663 infertile men with azoospermia: the clinical consequences. Human Reproduction. 2017; 32(12): 2574-80. https://doi.org/10.1093/humrep/dex307

Hassold T., Hunt P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2001; 2:280-291. https://doi.org/10.1038/35066065

Лебедев И.Н., Никитина Т.В. На пути от цитогенетики к цитогеномике ранних репродуктивных потерь. Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике. Новосибирск, 2014; 21: 3-84.

García-Mengual E. Triviño, Sáez-Cuevas J.C., Bataller A., Ruíz-Jorro J., M. Vendrell X. Male infertility: establishing sperm aneuploidy thresholds in the laboratory. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 2019; 36: 371-81. https://doi.org/10.1007/s10815-018-1385-0

Sarrate Z., Vidal F., Blanco J. Role of sperm fluorescent in situ hybridization studies in infertile patients: indications, study approach, and clinical relevance. Fertil Steril. 2010; 93(6):1892-1902. https://doi.org/10.1016/j.fertnstert.2008.12.139

Balasar Ö., Acar H. Investigation of the interchromosomal effects in male carriers with structural chromosomal abnormalities using FISH. Turk J. Urol. 2020; 46(3): 178-85. https://doi.org/10.5152/tud.2020.19255

Anton E., Vidal F., Blanco J. Reciprocal translocations: tracing their meiotic behavior. Genet Med. 2008; 10: 730-8. https://doi.org/10.1097/GIM.0b013e318187760f

Shi Q., Martin R.H. Aneuploidy in human spermatozoa: FISH analysis in men with constitutional chromosomal abnormalities, and in infertile men. Reproduction. 2001; 121(5): 655-66. https://doi.org/10.1530/rep.0.1210655

Тарлычева А.А., Маркова Ж.Г., Сорокина Т.М., Черных В.Б., Шилова Н.В.. Частота анеуплоидии в сперматозоидах у мужчин с нарушением фертильности. Медицинская генетика. 2020; 19(3): 89-90. https://doi.org/10.25557/2073-7998.2020.03.89-90

Calogero A.E., Burrello N., A De Palma, Barone N, D’Agata R., Vicari E. et al. Sperm aneuploidy in infertile men. Reproductive BioMedicine Online. 2003; 6(3): 310-7. https://doi.org/10.1016/S1472-6483(10)61850-0

Webster A., Schuh M. Mechanisms of Aneuploidy in Human Eggs. Trends in Cell Biology. 2017; 27(1):55-68. https://doi.org/10.1016/j.tcb.2016.09.002

Fakhrabadi M.P., Kalantar S.M., Montazeri F., Ashkezari M.D., Fakhrabadi M.P., Nejad Yazd S.S. FISH-based sperm aneuploidy screening in male partner of women with a history of recurrent pregnancy loss. Middle East Fertil Soc J. 2020; 25:23. https://doi.org/10.1186/s43043-020-00031-6

Calogero A.E., De Palma A., Grazioso C., Barone N., Romeo R., Rappazzo G., Rosario D’Agata R. Aneuploidy rate in spermatozoa of selected men with abnormal semen parameters. Human Reproduction. 2001; 16(6): 1172-9.

Chatziparasidou A., Christoforidis N., Samolada G., Nijs M. Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature. Andrologia. 2015; 47(8): 847-60. https://doi.org/10.1111/and.12362.

Racovita S., Mosin V., Capcelea S., Misina A., Sprincean M. Chromosomal abnormalities in men with azoospermia. The Moldovan Medical Journal. 2021; 64(1): 50-5. https://doi.org/10.5281/zenodo.4527139

Agarwal A., Said T. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Hum. Reprod. Update. 2003; 9: 331-45. https://doi.org/10.1093/humupd/dmg027

Braun R.E. Packaging paternal chromosomes with protamine. Nature Genetics. 2001; 28:10-2. https://doi.org/10.1038/ng0501-10

Брагина Е.Е., Арифулин Е.А., Лазарева Е.М., Лелекова М.А., Коломиец О.Л., Чоговадзе А.Г. и др. Нарушение конденсации хроматина сперматозоидов и фрагментация днк сперматозоидов: есть ли корреляция? Андрология и генитальная хирургия. 2017; 18(1): 48-61. https://doi.org/10.17650/2070-9781-2017-18-1-48-61

Арифулин Е.А., Брагина Е.Е., Замятнина В.А., Волкова Е.Г., Шеваль Е.В., Голышев С.А. и др. Компактизация ДНК в сперматогенезе человека. I. Динамика компактизации нуклеогистонного и нуклеопротаминного хроматина в дифференцирующихся сперматидах. Онтогенез. 2012; 43(2): 143-53.

Брагина Е.Е., Замятнина В.А., Бочарова Е.Н., Шилейко Л.В., Курило Л.Ф., Гусак Ю.К. Количественное ультраструктурное исследование хроматина сперматозоидов при нарушении фертильности. Андрология и генитальная хирургия. 2009; 1: 44-9. https://doi.org/10.17650/2070-9781-2014-1-41-50

Zirkin B.R., Perreault S.D., Naish S.J. Formation and function of the male pronucleus during mammalian fertilization. The Molecular Biology of Fertilization. 1989; 91-114.

Yanagimachi R. Mammalian fertilization. The Physiology of Reproduction. 2nd ed. 1994; 189-317.

Seligman J., Kosower N.S., Weissenberg R., Shalgi R. Thioldisulfide status of human sperm proteins. Journal of Reproduction and Fertility. 1994; 101: 435-43.

Motoishi M., Goto K., Tomita K., Ookutsu S., Nakanishi Y. Decondensation of bull and human sperm nuclei by dithiothreitol and/or heparin. Journal of Reproduction and Development. 1996; 42: 7-13.

Galli C., Vassilive I., Lagutina I., Galli A., Lazzari G. Bovine embryo development following ICSI: effect of activation, sperm capacitation and pre-treatment with dithiothreitol. Theriogenology. 2003; 60: 1467-80.

Santos T.A., Dias C., Brito R., Santos A.A. Analysis of Human Spermatozoa by Fluorescence In Situ Hybridization with Preservation of the Head Morphology Is Possible by Avoiding a Decondensation Treatment. J. Assist. Reprod. Genet. 2002; 19: 291-4. https://doi.org/10.1023/A:1015781330919

Arumugam M., Shetty D.P., Kadandale J.S., Nmilu S.K. Association of Sperm Aneuploidy Frequency and DNA Fragmentation Index in Infertile Men. J. Reprod. In-fertil. 2019; 20(3): 121-6.

Han J.C., Han G.Y. A procedure for quantitative determination of Tris(2-Carboxyethyl)phosphine, an odorless reducing agent more stable and effective than dithiothreitol. Anal. Biochem. 1994; 220(1): 5-10. https://doi.org/10.1006/abio.1994.1290

Roszkowski M., Mansuy I.M. High Efficiency RNA Extraction From Sperm Cells Using Guanidinium Thiocyanate Supplemented With Tris(2-Carboxyethyl)Phosphine. Front. Cell Dev. Biol. 2021; 9: 648274. https://doi.org/10.3389/fcell.2021.648274

Santarino I., Oliveira S.C.B., Oliveira-Brett A. Protein reducing agents dithiothreitol and tris(2-carboxyethyl)phosphine anodic oxidation. Electrochemistry Communications. 2012; 23: 114-7. https://doi.org/10.1016/j.elecom.2012.06.027

Ключевые слова