ОПЫТ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПАРАЛЛЕЛЬНОГО МЕТОДА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ТЕСТИРОВАНИЯ ПРИ ПОДОЗРЕНИИ НА МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ НОВООБРАЗОВАНИЯ И АЛГОРИТМ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОКАЗАНИЙ К ИССЛЕДОВАНИЮ

Аннотация

Соматические мутации в генах янускиназы 2 (JAK2,) кальретикулина (CARL) и рецептора тромбопоэтина (MPL) включены в число ключевых диагностических критериев клинических рекомендаций диагностики Ph-негативных миелопролиферативных новообразований (МПН). Улучшение доступности молекулярно-генетических технологий позволяет в короткие сроки определять данные мутации, сокращая диагностический процесс, но одновременно, назначение тестов без строгих показаний увеличивает количество необоснованных анализов. Это может приводить к снижению экономической эффективности лабораторной службы и дополнительному выполнению неоправданных, в том числе инвазивных гематологических обследований. С целью снижения необоснованных тестов при диагностике МПН ранее предложено правило принятия решений «JAK2-tree», основанное на предварительной оценке ограниченных показателей рутинного анализа крови: уровней гемоглобина, тромбоцитов, лейкоцитов. Для выявления высоко ассоциированного с мутацией гена JAK2 варианта МПН истинной полицитемии предложены аналогичные алгоритмы «JAKPOT» и «two-step». Такие подходы могут быть легко включены в алгоритмы электронных медицинских систем для выявления необоснованных запросов на тестирование. Результаты их использования демонстрируют снижение объёмов тестирования и увеличение эффективности выявления патологии без существенного снижения вероятности пропуска образцов с мутацией JAK2 V617F. Вместе с тем авторы не исследовали, каким образом предложенные алгоритмы могут предсказать вероятность выявления других диагностически важных для МПН мутаций в генах CALR и MPL. Многолетняя практика использования параллельного метода молекулярно-генетического тестирования образцов крови пациентов, направляемых врачами-гематологами КГБУЗ Краевой клинической больницы в лабораторию Красноярского филиала ФГБУ НМИЦ гематологии Минздрава России, позволила собрать достаточный объём данных для сравнительной ретроспективной оценки эффективности прогностических алгоритмов. Цель: анализ опыта использования параллельного метода молекулярно-генетического тестирования драйверных мутаций МПН и ретроспективная оценка прогностического значения алгоритмов их назначения в условиях реальной практики многопрофильного лечебного учреждения. Использована объединенная выборка из базы данных медицинской информационной системы КГБУЗ Красноярская краевая больница № 1 и Красноярского филиала ФГБУ НМИЦ гематологии Минздрава России с января 2012 года по май 2023 года. Обобщённая выборка включала 5886 неперсонифицированных записей первичного обследования взрослых пациентов, направленных врачами-гематологами с подозрением на МПН. При молекулярно-генетическом тестировании применялся параллельный алгоритм одновременного выявления пяти основных драйверных мутаций МПН с использованием набора реактивов для мультиплексной ПЦР «Миелоскрин» (ООО «Формула гена», Россия) в соответствии с инструкцией производителя. Результаты рутинного гематологического обследования венозной крови в образцах и последующего молекулярно-генетического исследованиям доступны в медицинской информационной системе у 922 пациентов. Статистический и «дендритный» анализ неперсонифицированной выборки из баз данных выполняли, используя программный пакет R. Среди 5886 обследованных пациентов выявляемость мутаций составила: JAK2V617F 27,2-30,9%, ins/del CALR 4,6-5,3%, MPLW515L/K, сочетанных вариантов — до 2,0%. Двукратное повышение за последние 3 года ежегодных объёмов тестирования снизило выявляемость мутаций не более чем на 5%. Ретроспективная оценка целесообразности ограничения объёма исследований правилом «JAK2-tree», либо критериями JAKPOT и «two-step», основанных на показателях рутинного гематологического анализа, привели бы к потере до 18% положительных результатов среди обследованных пациентов. Предложен альтернативный алгоритм принятия решения о показаниях к назначению молекулярно-генетических исследований, основанный на «дендритном анализе» накопленной базы данных результатов реальной практики, который дополнительно включает возраст пациента. Определены сочетания исходных показателей, при которых вероятность обнаружения драйверных мутаций МПН стремится к нулю и отдельные сочетания с максимальной (более 90%) вероятностью выявления мутации. Анализ 10-летнего опыта использования параллельного метода молекулярно-генетического тестирования пациентов с подозрением на МПН методом мультиплексной ПЦР продемонстрировал реальную возможность выявления всех пяти основных драйверных мутаций заболевания в одной аналитической серии. Предложенный на основе «дендритного» анализа алгоритм оценки вероятности выявления мутаций при интеграции в медицинскую информационную систему позволит с высокой степенью вероятности прогнозировать выявление драйверных мутаций, а также снизить долю необоснованных назначений.

Annotation

Somatic mutations in the Janus kinase 2 (JAK2,) calreticulin (CALR) and thrombopoietin receptor (MPL) genes are included among the key diagnostic criteria for the diagnosis of Ph-negative myeloproliferative neoplasms (MPN). Improving the availability of molecular genetic technologies makes it possible to determine these mutations in a short time, shortening the time of the diagnostic process, but at the same time, the appointment of tests without strict indications increases the number of unreasonably analyses. This, in turn, can lead to a decrease in the economic efficiency of laboratories, as well as to additional performance of unjustified, including invasive examinations. To reduce unreasonable tests in the diagnosis of MPN, the “JAK2 tree” rule was previously proposed, based on a preliminary assessment of limited indicators of a routine blood test (hemoglobin, platelets, and leukocytes). Similar «JAKPOT» and «two-step» algorithms have been proposed to identify a variant of MPN strongly associated with a JAK2 mutation, polycythemia vera. Such approaches can be easily incorporated into the algorithms of electronic medical systems to flag unreasonable requests for testing. The experience of their use demonstrates a significant reduction in the number of tests and an increase in the efficiency of pathology detection without a significant omission of samples with the JAK2 V617F mutation. At the same time, it has not been studied which algorithms can predict the detection of mutations in other CALR and MPL genes, which are also diagnostically significant for MPN. A long-term real practice of using a parallel method of testing blood samples simultaneously for all MPN driver mutations has accumulated a sufficient amount of data for a comparative assessment of the effectiveness of prognostic algorithms. Purpose: analyze the experience of using a parallel method of molecular genetic testing of MPN driver mutations and a retrospective assessment of the prognostic value of their prescription algorithms in real practice in a multidisciplinary medical institution. The work used a combined sample from the database of the medical information system of the Krasnoyarsk Regional Hospital No.1 and the Krasnoyarsk branch of the National Medical Research Center for Hematology of the Ministry of Health of Russia from January 2012 to May 2023. The joint data included 5886 non-personalized electronic medical records of patients with suspected MPN, referred after examination by hematologists. During molecular genetic testing, a parallel algorithm for the simultaneous detection of five major MPN driver mutations was used using the Myeloscreen multiplex PCR reagent kit (“Formula gene”, Russia). The results of routine hematological examination of venous blood in samples followed by molecular genetic studies were available in the medical information system in 922 patients. Statistical and «dendritic» database analysis was performed using the R software package. Among 5886 examined patients, the detection of mutations was: JAK2V617F 27.2-30.9%, ins/del CALR 4.6-5.3%, as well as MPLW515L/K and combined variants — up to 2.0%. A two-fold increase in annual testing volumes reduced the detection of mutations by no more than 5%. But a retrospective assessment of the feasibility of limiting the scope of studies to the rule of the «JAK2 tree», or the JAKPOT or «two-stage» criteria, based on the indicators of routine hematological analysis, would lead to a loss of up to 18% of positive results among the examined patients. An alternative algorithm for deciding on indications for the appointment of molecular genetic testing is proposed, based on the «dendritic analysis» of the accumulated database of real practice, including routine hematological parameters and the patient’s age. Combinations of initial indicators were determined, at which the probability of detecting mutations tends to zero, as well as individual combinations with the maximum (more than 90%) probability of detecting the JAK2 V617F mutation. The relatively high level of detection of these mutations (up to 35-37%) among patients in this study is also due to their preliminary selection after consultation with a hematologist. Analysis of the 10-year experience of using the parallel method of multiplex PCR in patients with suspected MPN showed a real possibility of detecting all five major driver mutations of the disease in one analytical series. The algorithm proposed based on «dendritic» analysis, when integrated into a medical information system, will allow predicting the detection of driver mutations with a high degree of probability, as well as reducing the proportion of unreasonable prescriptions.

Об авторах

Список литературы

1.Melikyan A.L., Kovrigina A.M., Subortseva I.N., Shuvaev V.A., Morozova E.V., Lomaia E.G. et al. National Clinical Guidelines on Diagnosis and Treatment of Ph-Negative Myeloproliferative Neoplasms (Polycythemia Vera, Essential Thrombocythemia, and Primary Myelofibrosis) (еd. 2020). Gematologiya i transfuziologiya. 2021;14(2):262-98. (in Russian)
2.Khoury J. D., Solary E., Abla O., Akkari Y., Alaggio R., Apperley J. F. et al. The 5th edition of the World Health Organization Classification of Haematolymphoid Tumours: Myeloid and Histiocytic/Dendritic Neoplasms. Leukemia. 2022; 36(7):1703-19. DOI: 10.1038/s41375-022-01613-1.
3.Sandes A.F., Gonçalves M.V., Chauffaille M.L. Frequency of polycythemia in individuals with normal complete blood cell counts according to the new 2016 WHO classification of myeloid neoplasms. Int. J. Lab. Hematol. 2017; 39(5):528-31. DOI: 10.1111/ijlh.12686.
4.Muhsen I.N., Shyr D., Sung A.D., Hashmi S.K. Machine Learning Applications in the Diagnosis of Benign and Malignant Hematological Diseases. Clin. Hematol. Int. 2020; 3(1):13-20. DOI: 10.2991/chi.k.201130.001.
5.Hoermann G. Clinical Significance of Clonal Hematopoiesis of Indeterminate Potential in Hematology and Cardiovascular Disease. Diagnostics (Basel). 2022; 12(7):1613. DOI: 10.3390/diagnostics12071613.
6.Mahe E., Pedersen K.M., Çolak Y., Bojesen S.E., Lynch T., Sinclair G. et al. JAK2-tree: a simple CBC-based decision rule to guide appropriate JAK2 V617F mutation testing. J. Clin. Pathol. 2019; 72:172-6. DOI: 10.1136/jclinpath-2018-205527.
7.Chin-Yee B., Bhai P., Cheong I., Matyashin M., Hsia C.C., Kawata E. et al. A Rational Approach to JAK2 Mutation Testing in Patients with Elevated Hemoglobin: Results from the JAK2 Prediction Cohort (JAKPOT) Study. J. Gen. Intern. Med. 2022; 38(8):1828-33. DOI: 10.1007/s11606-022-07963-x.
8.Piris-Villaespesa M., Álvarez-Larrán A., Saez-Marín A., Nuñez-Torrón C., Muñoz-Martin G., Sánchez R. et al. Development and validation of a sequential two-step algorithm for the screening of individuals with potential polycythaemia vera. Sci. Rep. 2021; 11(1):209. DOI: 10.1038/s41598-020-80459-y.
9.Olkhovskiy I.A., Stolyar M.A., Gorbenko A.S. A set of reagents for detecting ph-negative myeloproliferative neoplasms and a diagnostic method based on it. Patent RF № 2679653; 2019. (in Russian)
10.Gorbenko A.S., Stolyar M.A., Subbotina T.N., Mikhalev M.A., Olkhovsky I.A. Developing method for allelic somatic mutations burden of Janus kinase 2 (V617F JAK2) detection in pools of venous blood samples. Laboratornaya sluzhba. 2016; 5(1):19-25. DOI: 10.17116/labs20165119-25. (in Russian)
11.Johnson S., Baker B. A CBC algorithm combined with immature platelet fraction is able to identify JAK2 V617F mutation-positive polycythaemia vera patients. Int. J. Lab. Hematol. 2019; 41(2):271-6. DOI: 10.1111/ijlh.12967.
12.Salinas M., López-Garrigós M., Flores E., Leiva-Salinas M., Asencio A., Lugo J. et al. Managing inappropriate requests of laboratory tests: from detection to monitoring. Am. J. Manag. Care. 2016; 22:e311-6.
13.Langabeer S.E. An increase in diagnostic JAK2 V617F mutation testing: Is masked polycythaemia vera the explanantion? Eur. J. Intern. Med. 2018; 52:e37-e38. DOI: 10.1016/j.ejim.2018.03.017.
14.Goulding C., Uttenthal B., Foroni L., Duke V., Traore A., Kottaridis P. et al. The JAK2 (V617F) tyrosine kinase mutation identifies clinically latent myeloproliferative disorders in patients presenting with hepatic or portal vein thrombosis. Int. J. Lab. Hematol. 2008; 30:415-9. DOI: 10.1111/j.1751-553X.2007.00973.x.
15.Shetty S., Kulkarni B., Pai N., Mukundan P., Kasatkar P., Ghosh K. JAK2 mutations across a spectrum of venous thrombosis cases. Am. J. Clin. Pathol. 2010; 134:82-5. DOI: 10.1309/AJCP7VO4HAIZYATP.
16.Olkhovskiy I.A., Gorbenko A.S., Stolyar M.A., Griscchenko D.A., Tkachenko O.A., Martsinkevich T.L. et al. Somatic mutation of the V617F JAK2 gene in patients of the cardiovascular diseases. Terapevticheskiy аrkhiv. 2019; 91(7):25-8. DOI: 10.26442/00403660.2019.07.000245. (in Russian)
17.Gorbenko A.S., Stolyar M.A., Olkhovskiy I.A., Vasiliev E.V., Mikhalev M.A Parallel algorithm for myeloproliferative neoplasms testing: the frequency of double mutations is found in the JAK2/MPL genes more often than the JAK2/CALR genes, but is there a clinical benefit? Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 2019; 57(4): E60-E62.
18.Ahmed R.Z., Rashid M., Ahmed N., Nadeem M., Shamsi T.S. Coexisting JAK2V617F and CALR exon 9 mutations in myeloproliferative neoplasms — do they designate a new subtype? Asian Pac. J. Cancer Prev. 2016; 17: 923-6. DOI: 10.7314/apjcp.2016.17.3.923.

Ключевые слова