ОПЫТ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УРОВНЯ ОКИСЛЕННО МОДИФИЦИРОВАННЫХ БЕЛКОВ В СПЕРМАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ

Аннотация

Среди причин мужского бесплодия достаточно внимания уделяется окислительному стрессу, который, в свою очередь, является патогенетическим звеном воспалительного процесса. Однако подходы к определению окисленно модифицированных белков (ОМБ) не адаптированы при использовании биологических материалов, кроме сыворотки периферической крови. Цель исследования – изучить уровень окисленно модифицированных белков в спермальной жидкости практически здоровых мужчин. В исследовании использовали 54 образца эякулята от практически здоровых мужчин, у которых отсутствовал рост микроорганизмов на питательных средах. У всех добровольцев получали пробы сыворотки периферической крови. В исследовании использовали два варианта методики определения ОМБ. В первом случае образцы предварительно обрабатывали 10% раствором сульфата стрептомицина для осаждения нуклеиновых кислот и свободных аминокислот. Во втором случае не проводили инкубацию образцов с раствором сульфата стрептомицина, а сразу переходили к исследованию нативного эякулята. Определение уровня ОМБ проводили с помощью 0,1 M раствора 2,4-динитрофенилгидразина. Образовавшиеся 2,4–динитрофенилгидразоны (ДНФ) регистрировали при 365 нм для оценки кетон-ДНФ нейтрального характера, при 432 нм – кетон-ДНФ основного характера и при 530 нм – альдегид-ДНФ нейтрального характера. При определении содержания карбонилов использовали молярный коэффициент поглощения, равный 22,000 M-1см-1. Концентрацию окисленных белков выражали в нмоль/мг общего белка исследуемой биологической жидкости. Для определения концентрации белка использовали биуретовый метод (Вектор-Бест, Новосибирск). Статистический анализ результатов проводили с использованием методов описательной статистики и t-критерия Стьюдента для парных данных. Суммарная концентрация ОМБ в нативной спермальной жидкости, не обработанной сульфатом стрептомицина, составила 3,6±0,4 нмоль/мг белка, после её обработки сульфатом стрептомицина – 0,6±0,1 нмоль/мг общего белка (p<0,05). При этом в спермальной жидкости практически здоровых добровольцев преобладают кетоновые производные, что может быть обусловлено длительно действующими факторами. Предложен удобный в использовании в большинстве лабораторий способ для нивелирования неспецифического окрашивания при определении окисленно модифицированных белков в спермальной жидкости.

Annotation

Among the causes of male infertility, enough attention is paid to oxidative stress, which in turn is a pathogenetic link in the inflammatory process. However, approaches to the determination of oxidized modified proteins are not adapted for use when using biological materials other than peripheral blood serum. The aim of investigation was to study the level of oxidized modified proteins in the sperm fluid of healthy men. 54 ejaculate samples from apparently healthy men who did not grow microorganisms on nutrient media were observed. All volunteers received peripheral blood serum samples. Two variants of the method for determining the oxidized modified proteins were used. In the first case, the samples were pre-treated with a 10% streptomycin sulfate solution to precipitate nucleic acids and free amino acids. In the second case, the samples were not incubated with a solution of streptomycin sulfate, but immediately proceeded to the study of native ejaculate. Determination of the level of oxidized modified proteins was carried out using a 0.1M solution of dinitrophenylhydrazine. The resulting 2,4-dinitrophinylhydrazones (DNP) were recorded at 365 nm to assess neutral ketone-DNP, at 432 nm – basic ketone-DNP, and at 530 nm – neutral aldehyde-DNP. When determining the carbonyl content, a molar absorption coefficient of 22,000 M-1cm-1 was used. The concentration of oxidized proteins was expressed in nmol/mg of the total protein of the studied biological fluid. The protein concentration was determined using the biuret method (Vector-Best, Russia). Statistical analysis of the results was performed using descriptive statistics and Student’s t-test for paired data. The total concentration of oxidized modified proteins in native spermal fluid not treated with streptomycin sulfate was 3.6±0.4 nmol/mg of protein, after treatment with streptomycin sulfate it was 0.6±0.1 nmol/mg of total protein (p<0.05 ). At the same time, ketone derivatives predominate in the semen of practically healthy volunteers, which may be due to long-acting factors. A method convenient for use in most laboratories for leveling non-specific staining in the determination of oxidized proteins in semen has been proposed.

Об авторах

Список литературы

1. Levine H., Jørgensen N., Martino-Andrade A., Mendiola J., Weksler-Derri D., Jolles M. et al. Temporal trends in sperm count: a systematic review and meta-regression analysis of samples collected globally in the 20th and 21st centuries. Hum. Reprod. Update. 2023; 29(2): 157-76.
2. Vavilov N.V., Mal’tsev N.A., Godovalov A.P. The content of immunoglobulins of different classes in sperm plasma in asymptomatic bacteriospermia. Meditsinskaya immunologiya. 2017; 19(S): 255. (in Russian)
3. Esteves S.C. Clinical relevance of routine semen analysis and controversies surrounding the 2010 World Health Organization criteria for semen examination. Int. Braz. J. Urol. 2014; 40(4): 443-53.
4. De Jonge C., Barratt C.L.R. The present crisis in male reproductive health: an urgent need for a political, social, and research roadmap. Andrology. 2019; 7(6): 762-8.
5. Bieniek J.M., Drabovich A.P., Lo K.C. Seminal biomarkers for the evaluation of male infertility. Asian J. Androl. 2016; 18(3): 426-33.
6. Kovac J.R., Pastuszak A.W., Lamb D.J. The use of genomics, proteomics, and metabolomics in identifying biomarkers of male infertility. Fertil. Steril. 2013; 99(4): 998-1007.
7. Hawkins C.L., Davies M.J. Detection, identification, and quantification of oxidative protein modifications. J. Biol. Chem. 2019; 294(51): 19683-708.
8. Reznick A.Z., Packer L. Oxidative Damage to Proteins: Spectrophotometric Method for Carbonyl Assay. Methods in enzymology. 1994; 233: 357-63.
9. Vavilov N.V., Shilov Yu.I., Godovalov A.P. Methodological aspects of determining the oxidative modification of a protein. Meditsinskiy al’manakh. 2018; 53(2): 19-22. (in Russian)
10. Dubinina E.E., Gavrovskaya S.V., Kuz’mich E.V., Leonova N.V., Morozova M.G., Kovrugina S.V., Smirnova T.A. Oxidative modification of proteins: tryptophan oxidation and bityrosine formation in purified proteins using the Fenton system. Biokhimiya. 2002; 67(3): 413-21. (in Russian)
11. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 5th ed. WHO, Geneva; 2010.
12. Ryabov G.A., Azizov Yu.M., Dorokhov S.I., Kulabukhov V.V., Titova I.A., Pasechnik I.N. et al. Oxidative modification of blood plasma proteins in critically ill patients. Anesteziologiya i reanimatologiya. 2000; 2: 72-5. (in Russian)
13. Boev K.V., Vasilenko D.V., Maslov A.I. Free-radical oxidation of proteins: methodological aspects of the quantitative assessment of oxidative modification by the reaction with 2,4-dinitrophenylhydrazine. Universum: Khimiya i biologiya. 2014; 1(2): 3-8. (in Russian)
14. Hill G.E., Ruggeroli A., Pohorecki R., Alonso A., Robbins R.A. Cigarette smoking reduces endogenous airway nitric oxide production during cardiopulmonary bypass in humans. Anesth. Analg. 1995; 81(1): 170-2.
15. Kopytova T.V., Panteleeva G.A., Dmitrieva O.N., Kotkova E.V. Evaluation of oxidative modification of proteins in patients with chronic widespread dermatoses. Klinicheskaya Laboratornaja Diagnostika. 2014; 2: 41-4. (in Russian)
16. Liang S., Ji L., Kang L., Hu X. Metabolic regulation of innate immunity. Adv. Immunol. 2020; 145: 129-57.
17. Kolesnikova L.I., Kurashova N.A., Osadchuk L.V., Osadchuk A.V., Dolgikh M.I., Dashiev B.G. Parameters of Pro- and Antioxidant Status in Ejaculate of Men of Fertile Age. Bull. Exp. Biol. Med. 2015; 159(6): 726-8.

Ключевые слова