Аннотация
В условиях широкого распространения лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза (МБТ) необходимость ускоренных, в том числе фенотипических, методов определения чувствительности микобактерий к антимикробным химиотерапевтическим препаратам в клинических образцах является актуальным вопросом. Представлены результаты применения ускоренного фенотипического метода определения чувствительности к антимикробным химиотерапевтическим препаратам клинических штаммов МБТ на основе применения литического микобактериофага D29. Принцип метода состоит в оценке размножения микобактериофага в клетках МБТ в зависимости от ингибирования метаболизма растущих микобактерий в присутствии чувствительных к ним антибактериальных препаратов. Размножение микобактериофага оценивается посредством количественного анализа ДНК фага в полимеразной цепной реакции в реальном времени (ПЦР-РВ). В работе использованы 102 клинических штамма МБТ, полученные после первичного культивирования или рекультивирования в пробирках системы MGIT (Bactec). После получения положительных результатов роста МБТ образцы инкубировали в течение 48 ч в CO2-инкубаторе в присутствии критических концентраций 10 широко употребляемых при лечении туберкулеза лекарственных субстанций в жидкой питательной среде Миддлбрук 7H9, обогащенной компонентами OADC, в формате 24-луночного культурального планшета с объемом питательной среды 1 мл на лунку, после чего в лунки планшета вносили 2·• 103 плакобразующих единиц микобактериофага D29. Через 24 ч проводилось количественное определение ДНК фага с помощью ПЦР-РВ с использованием реагентов фаг D29, ООО «Синтол». Увеличение порогового уровня флюоресценции Ct более чем на 2 цикла в пробах с антибиотиком в сравнении с контролем свидетельствует о чувствительности исследуемого штамма МБТ к антибиотику. При сравнительном исследовании с посевом на питательную среду Левенштейна — Йенсена уровень совпадений полученных результатов составил 91%. При сравнительном исследовании с тест-системой Bactec ограниченного числа штаммов с определением чувствительности для 10 препаратов уровень совпадений результатов — 96%. Подтверждены данные об обратной зависимости величины ΔCt и минимальной ингибирующей концентрации препарата. Отмечена предполагаемая высокая эффективность возможного набора реагентов на основе приведенного метода по критерию цена/качество.
Об авторах
Владимирский Михаил АлександровичФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова», НИИ фтизиопульмонологии, Минздрава РФ 127994, Москва д-р мед. наук, проф., зав. лаб. иммунол. исследований и мол. диагностики туберкулёза mvladimirskij@mail.ru
Список литературы
Владимирский М.А., Аляпкина Ю.С., Алексеев Я.И., Варламов Д.А., Домотенко Л.В., Шипина Л.К. и др. Применение метода ПЦРвреальном времени для определения и контроля за распространением лекарственно устойчивых штаммов микобактерий туберкулёза. Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. 2008; 4: 38-44
Enarson D.A., Harries A.D. Historical background and global epidemiology of Mycobacterium tuberculosis resistance. In: Guidelines for Clinical and Operational Management of Drug-Resistant Tuberculosis. International Union Against Tuberculosis and Lung Disease. Paris, France: 2013; 7-12.
Pandey P., Dutt Pant N., Rijal K.R., Shrestha B., Kattel S., Banjaraet M.R. et al. Diagnostic Accuracy of GeneXpert MTB/RIF Assay in Comparison to Conventional Drug Susceptibility Testing Method for the Diagnosis of Multidrug-Resistant Tuberculosis. PLoS One. 2017; 12(1): e0169798.
Feng Y., Liu S., Wang Q., Wang L., Tang S., Wang J. et al. Rapid Diagnosis of Drug Resistance to Fluoroquinolones, Amikacin, Capreomycin, Kanamycin and Ethambutol Using Genotype MTBDRsl Assay: A Meta-Analysis. PLOS one. 2013; 8(2):1-13.
Wei-Lun Huang, Ting-Lin Chi, Mei-Hua Wu, Ruwen Jou. Performance Assessment of the GenoType MTBDRsl Test and DNA Sequencing for Detection of Second-Line and Ethambutol Drug Resistance among Patients Infected with Multidrug-Resistant Mycobacterium tuberculosis, J. Clin. Microbiol. 2011; @2502-8.
Banaiee N., Bobadilla-Del-Valle M., Bardarov S. Jr., Riska P.F., Small P.M., Ponce-De-Leon A. et al. Luciferase reporter mycobacteriophages for detection, identification, and antibiotic susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in Mexico. J. Clin. Microbiol. 2001; 39: 3883-8.
Jain P., Hartman T.E., Eisenberg Nell, O’Donnell M.R., Kriakov J., Govender K. et al. ɸ2GFP10, a High-Intensity Fluorophage, Enables Detection and Rapid Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis Directly from Sputum Samples. J. Clin. Microbiol. 2012; 50(4): 1362-9.
Xia Yu, Yunting Gu, Guanglu Jiang, Yifeng Ma, Liping Zhao, Zhaogang Sun, Paras Jain et al. Evaluation of a High-Intensity Green Fluorescent Protein Fluorophage Method for Drug-Resistance Diagnosis in Tuberculosis for Isoniazid, Rifampin and Streptomycin. Frontiers in Microbiology. 2016; 7, article 922: 1-6.
Eltringham J.S., Wilson M., Drobniewski F.A. Evaluation of a Bacteriophage-Based Assay (Phage Amplified Biologically Assay) as a Rapid Screen for Resistance to Isoniazid, Ethambutol, Streptomycin, Pyrazinamide, and Ciprofloxacin among Clinical Isolates of Mycobacterium tuberculosis. Journal of Clinical Microbiology. 1999; 37(11): 3528-32.
Foongladda S., Klayut W., Chinli R., Pholwat S., Houpt Eric. Use of Mycobacteriophage Quantitative PCR on MGIT Broths for a Rapid Tuberculosis Antibiogram. Journal of Clinical Microbiology. 2014; 52(5): 1523-8.
Pholwat S., Ehdaie B., Foongladda S., Kelly K., Houpt E. Real-Time PCR Using Mycobacteriophage DNA for Rapid Phenotypic Drug Susceptibility Results for Mycobacterium tuberculosis. J. Clin. Microbiol. 2012, 50(3): 754-61.