Аннотация
Проникновение бактерий внутрь эукариотических клеток — широко распространенное явление. В последнее время описана способность различных микроорганизмов проникать внутрь эритроцитов, что часто приводит к развитию бактериемии и сепсиса. Существуют разные методы обнаружения бактерий в кровотоке, характеризующиеся различной эффективностью и длительностью процедуры. Общепринятые микробиологические методы диагностики длительны и ограничены в выявлении некультивируемых форм микроорганизмов. Существуют молекулярно-генетические методы диагностики бактериемии и сепсиса, позволяющие сокращать время проведения исследований и выявлять широкий спектр микроорганизмов. Цель данного исследования — разработка оптимального протокола флуоресцентной in situ гибридизации для изучения взаимодействия бактерий с эритроцитами. Представлены результаты применения молекулярно-генетического метода FISH, адаптированного для выявления бактерий, расположенных на поверхности и внутри эритроцитов. Разработан оптимальный протокол фиксации эритроцитов, исключающий их лизис, на основе тестирования разных видов антикоагулянтов и концентраций фиксирующих растворов. Подобраны температурный режим и оптимальное время гибридизации образцов с флуоресцентными зондами, меченными FITC. С помощью люминесцентной и конфокальной лазерной сканирующей микроскопии по характерному свечению обнаружены адгезия и внутриэритроцитарная локализация бактерий в исследуемых образцах крови. При использовании FISH время исследования сокращается до 8-12 ч. Одновременно проводят идентификацию микроорганизмов, так как ДНК и рРНК бактерий гибридизуется с ДНК-зондами, комплементарными таксон-специфическим участкам гена 16S рРНК. Другое преимущество FISH — возможность проведения лабораторной диагностики бактериемии и сепсиса в образцах крови больных без выделения гемокультуры.
Список литературы
Розов С.М., Дейнеко Е.В. Бактериальные внутриклеточные патогены: стратегии нападения и защиты. Успехи современной биологии. 2015; 135 (5): 464-79
Potgieter M., Bester J., Douglas B. Kell, Pretorius E. The dormant blood microbiome in chronic, inflammatory diseases. Microbiology Reviews. 2015; fuv013: 39: 567-91.
Dechio C. Infection-associated type IV secretion systems of Bartonella and their diverse roles in host cell interaction. Cell Microbiol. 2008: 10 (8): 1591-8.
Rolain J.M., Maurin M., Mallet M.N., Parzy D., Raoult D. Culture and antibiotic susceptibility of Bartonella quintana in human erythrocytes. Antimicrob. Agents Ch. 2003; 47: 614-9.
Vitry M.A, Hanot Mambres D., Deghelt M., Hack K., Machelart A., Lhomme F. et al. Brucella melitensis invades murine erythrocytes during infection. Infect. Immun. 2014; 82: 3927-38.
Yamaguchi M., Terao Y., Mori-Yamaguchi Y., Domon H., Sakaue Y., Yagi T. et al. Streptococcus pneumoniae invades erythrocytes and utilizes them to evade human innate immunity. PLoS One. 2013; 8: e77282.
Zhang Y., Zou Y., Ma P., Muhammad H.M., Li Y., Jiang P. Identification of Mycoplasma suis MSG1 interaction proteins on porcine erythrocytes. Arch. Microbiol. 2014; 80: 7551-60.
Щуплова Е.А., Стадников А.А., Фадеев С.Б. Роль биологических свойств Staphylococcus epidermidis во внутриэритроцитарной инвазии и изменении активности каталазы и супероксиддисмутазы эритроцитов при экспериментальной генерализованной инфекции. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2015; 159 (1): 79-82
Norman G. Miller, Richard B. Wilson. In vivo and vitro observations of Leptospira pomona by electron microscopy. Microbiologe. 1962; 6: 569-74
Руднов В.А. Сепсис: современные подходы к диагностике и интенсивной терапии. Вестник анестизиологии и реанимотологии. 2010; 7 (1): 48-57
Schaub N., Frei R., Muller C. Addressing unmet clinical needs in the early diagnosis of sepsis. Swiss Med. Wkly. 2011; 141: w13244.
Frickmann H., Zautner A.E., Moter A., Kikhney J., Hagen R.M., Stender H., et al. Fluorescence in situ hybridization (FISH) in the microbiological diagnostic routine laboratory: a review. Crit. Rev. Microbiol. 2017; 43 (3): 263-93.
Torres C. E., Gibello A., Nande M., Martin M., Blanco A. Fluorescent in situ hybridization and flow cytometry as tools to evaluate the treatments for the control of slime-forming enterobacteria in paper mills. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2008; 78: 889-97.
Malic S., Hill K.E., Hages A., Percival S.L., Thomas D.W., Williams D.W. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 2009; 155: 2603-11.
Лобов И.А., Давлеткильдеев Н.А. Влияние способа подготовки образца на морфофункциональные характеристики эритроцитов при исследовании методом атомно-силовой микроскопии. Вестник Омского университета. 2013; 2: 129-32.
Попов Д.А., Овсеенко С.Т., Осипов Г.А., Вострикова Т.Ю. Ускоренный способ идентификации возбудителей бактериемий с применением метода газовой хромато-масс-спектрометрии. Клиническая лабораторная диагностика. 2013; 5: 54-8.
Гаврилов С.Н., Скачкова Т.С., Шипулина О.Ю., Савочкина Ю.А., Шипулин Г.А., Малеев В.В. Современные молекулярно-генетические методы, используемые для этиологической диагностики сепсиса. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2016; 2: 91-9.
Calderaro A., Martinelli M., Motta F., Larini S., Arcanqeletti M.C., Medici M.C. et.al. Comparison of peptide nucleic acid fluorescencein situ hybridization assays with culture-based matrix-assisted laser desorption/ ionization-time of flight mass spectrometry for the identification of bacteria and yeasts from blood cultures and cerebrospinal fluid cultures. Clin. Microbiol. Infect. 2014; 20: O468-75.
Laub R.R., Knudsen J.D. Clinical consequences of using PNA-FISH in Staphylococcal bacteraemia. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2014; 33: 599-601.