РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ МРНК ГЕНА JAK2 В ВЕНОЗНОЙ КРОВИ И ОЦЕНКА ЕГО ДИАГНОСТИЧЕСКОГО ЗНАЧЕНИЯ В ОНКОГЕМАТОЛОГИИ

Аннотация

Избыточная активность сигнальных путей, опосредованных янускиназой-2 (JAK2), в клетках костного мозга и крови определяет высокий уровень готовности к реализации иммунных воспалительные реакции и нарушений гемостаза. Ряд мутаций в гене JAK2 действуют как движущие силы патогенеза миелопролиферативной неоплазии (МПН), вовлечены в развитие отдельных вариантов острых лейкозов, ряда солидных злокачественных образований, а также кардиоваскулярных заболеваний. В качестве маркера, отражающего уровень активности этого фермента, предложено использовать тесты количественного определения мРНК JAK2 в циркулирующих клетках крови.
Цель: разработка оригинальной методики выявления мРНК JAK2 в венозной крови и оценка возможного диагностического значения при хронических онкогематологических заболеваниях. Разработка метода ПЦР-РВ для определения экспрессии мРНК гена JAK2 в образцах венозной крови выполнялась в соответствии с требованиями MIQE. Дизайн праймеров и TaqMan зондов подбирали, используя программу Primer3 с учетом возможности исключения последующей обработки ДНКазой. Оценивалась стабильность исследуемого мРНК в вакутейнерах с разными наполнителями и в зависимости от времени хранения образцов. Уровень мРНК JAK2 определяли в лейкоцитах крови 41 пациента с В-ХЛЛ, 16 пациентов с ХМЛ, 12 пациентов с множественной миеломой и 39 доноров и здоровых добровольцев. Показано, что значения относительной экспрессии мРНК JAK2 значимо не зависят от используемого антикоагулянта и стабильны в диапазоне 2 – 7 часов после взятия крови в вакутейнере с ЭДТА. Выявлено снижение уровня мРНК JAK2 в пробах венозной крови у пациентов с первичными ХЛЛ и с множественной миеломой, но не при ХМЛ. Уровень маркера у большинства пациентов с ХЛЛ после начала терапии приближался к диапазону, характерному для здоровых людей.
Разработан оригинальный метод ПЦР-РВ для количественного определения мРНК JAK2 в образцах венозной крови, соответствующий требованиям системы MIQE. Определение мРНК JAK2 будет полезным для уточнения особенностей патогенеза отдельных заболеваний, вовлекающих нарушение синтеза и активности JAK2, а также может стать дополнительным маркером прогноза и оценки эффективности терапии при отдельных онкогематологических заболеваниях.

Об авторах

Список литературы

O’Shea J.J., Holland S.M., Staudt L.M. JAKs and STATs in immunity, immunodeficiency, and cancer. N. Engl. J. Med. 2013;368:161–70. https://doi.org/10.1056/NEJMra1202117

Qian D., Liu L., Zhu T., Wen L., Zhu Z., Yin X. et al. JAK2 and PTPRC mRNA expression in peripheral blood mononuclear cells from patients with systemic lupus erythematosus. Clin. Rheumatol. 2020;39:443–8. https://doi.org/10.1007/s10067-019-04778-w

Nauroy P., Delhommeau F., Baklouti F. JAK2V617F mRNA metabolism in myeloproliferative neoplasm cell lines. Blood Cancer J. 2014;4(6):e222. https://doi.org/10.1038/bcj.2014.43

Perner F., Perner C., Ernst T., Heidel F.H. Roles of JAK2 in Aging, Inflammation, Hematopoiesis and Malignant Transformation. Cells. 2019;8(8):854. https://doi.org/10.3390/cells8080854

Miller C.P., Thorpe J.D., Kortum A.N., Coy C.M., Cheng W.Y., Ou Yang, T.H. et al. JAK2 expression is associated with tumor-infiltrating lymphocytes and improved breast cancer outcomes: implications for evaluating JAK2 inhibitors. Cancer Immunol. Res. 2014;2(4):301-6. https://doi.org/10.1158/2326-6066.CIR-13-0189

Ольховский И.А., Горбенко А.С., Столяр М.А., Грищенко Д.А., Ткаченко О.А., Марцинкевич Т.Л. Частота выявления соматической мутации V617F в гене JAK2 у пациентов с сердечно-сосудистой патологией. Терапевтический архив. 2019;91(7): 27-30.

Vreća M., Zeković A., Damjanov N., Andjelković M., Ugrin M., Pavlović S. et al. Expression of TLR7, TLR9, JAK2, and STAT3 genes in peripheral blood mononuclear cells from patients with systemic sclerosis. J. Appl. Genet. 2018;59(1):59-66. https://doi.org/10.1007/s13353-017-0415-4 PMID: 29147913.

Milara J., Hernandez G., Ballester B., Morell A., Roger I., Montero P. et al. The JAK2 pathway is activated in idiopathic pulmonary fibrosis. Respir. Res. 2018;19(1):24. https://doi.org/10.1186/s12931-018-0728-9

Bose P., Verstovsek S. JAK2 inhibitors for myeloproliferative neoplasms: what is next? Blood. 2017;130(2):115-25. https://doi.org/10.1182/blood-2017-04-742288

Насонов Е.Л., Лила А.М. Ингибиторы Янус-киназ при иммуновоспалительных ревматических заболеваниях: новые возможности и перспективы. Научно-практическая ревматология. 2019;57(1):8-16.

Vannucchi A.M., Sordi B., Morettini A., Nozzoli C., Poggesi L., Pieralli F. et al. Compassionate use of JAK1/2 inhibitor ruxolitinib for severe COVID-19: a prospective observational study. Leukemia. 2020;1-13. https://doi.org/10.1038/s41375-020-01018-y

Olkhovskiy I.A., Gorbenko A.S., Stolyar M.A., Komina A.V., Vasiliev E.V., Mikhalev M.A. et al. A Strong Correlation of the HIF1a mRNA Expression Level with the Total Expression of JAK2, As Well As a Decrease in Their Level Is Observed in Leukocytes of Patients with MPN and Lymphoproliferative Cancer. Blood. 2019; 134 (Supplement_1):5032.

Bustin S.A., Benes V., Garson J.A., Hellemans J., Huggett J., Kubista M. et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin. Chem. 2009;55(4): 611-22. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797 PMID: 19246619.

Untergasser A., Cutcutache I., Koressaar T., Ye J., Faircloth B.C., Remm M. et al. Primer3 – new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Res. 2012; 40(15): e115. https://doi.org/10.1093/nar/gks596

Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)). Method. 2001;25: 402–8.

Whitney A.R., Diehn M., Popper S.J., Alizadeh A.A., Boldrick J.C., Relman D.A. et al. Individuality and variation in gene expression patterns in human blood. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 2003;100(4):1896-1901. https://doi.org/10.1073/pnas.252784499

The Human Protein Atlas. Available at: https://www.proteinatlas.org/ENSG00000096968-JAK2 (accessed 28 January 2021).

Ключевые слова