РАЗРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ КАЧЕСТВЕННОГО ВЫЯВЛЕНИЯ РНК ВИРУСА ГЕПАТИТА С В КЛИНИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ С ГИБРИДИЗАЦИОННО-ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ

Аннотация

Гепатит С является одним из наиболее распространенных хронических заболеваний печени в мире и вызывается инфекцией вируса гепатита С (ВГС), которое может привести к тяжелым последствиям – циррозу, раку печени (гепатоцеллюлярной карциноме, ГЦК) и летальному исходу. Согласно стратегии Всемирной организации здравоохранения на 2022–2030 гг. подчеркивается важнейшая роль сектора здравоохранения в прекращении эпидемии. По данным руководства Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), опубликованному в 2016 году, число смертей от заболеваний, связанных с ВГС увеличивается, а смертность пациентов от ВГС-ассоциированного цирроза и печеночно-клеточного рака будет продолжать расти, если в клинике не будут применяться более эффективные методы лечения. К настоящему времени накоплен большой опыт ведения и лечения пациентов с гепатитом С, который положен в основу представ-ленных рекомендаций. Таким образом, обнаружение ВГС с помощью простого, быстрого, но высокочувствительного и специфичного метода ПЦР может помочь уменьшить глобальное бремя ВГС на здравоохранение во всем мире. В статье описывается разработка набора реагентов для выявления нуклеиновой кислоты РНК вируса гепатита С методом ПЦР-РВ, что позволит диагностировать пациентов на разных стадиях инфекции, определять эффективность проводимого антиретровирусного лечения. Общая диагностическая чувствительность разрабатываемого набора составляет 100%, а специфичность — 100%, взятых у 200 пациентов с подтверждённым и отрицательным результатом по ВГС. На основании 200 образцов плазмы и сыворотки крови при использовании набора методом ПЦР в реальном времени ложно-положительных реакций выявлено не было. Данные демонстрируют потенциал использования внутреннего эндогенного образца (ЭВКО), использующего в качестве мишеней гены человека и позволяющий судить о наличие клеток человека в образце и правильности проведения этапа пробоподготовки.

Annotation

Hepatitis C is one of the most common chronic liver diseases in the world and is caused by infection with hepatitis C virus (HCV), which can lead to severe consequences — cirrhosis, liver cancer (hepatocellular carcinoma, HCC) and death. The World Health Organization’s strategy 2022-2030 underlines the critical role of the health sector in ending the epidemic. According to World Health Organization (WHO) guidelines published in 2016, deaths from HCV-related diseases are increasing, and patient mortality from HCV-associated cirrhosis and liver cell cancer will continue to rise unless more effective treatments are used in the clinic. There is now a wealth of experience in the management and treatment of patients with hepatitis C, which forms the basis of the recommendations presented. Thus, detection of HCV using a simple, rapid but highly sensitive and specific PCR method can help to reduce the global HCV burden on public health worldwide. This article describes the development of a reagent kit for the detection of hepatitis C virus RNA nucleic acid by PCR-RV, which will enable the diagnosis of patients at different stages of infection and determine the effectiveness of antiretroviral treatment administered. Total diagnostic sensitivity of developed kit is 100 %, and specificity – 100 %, taken from 200 patients with confirmed and negative HCV results. Based on 200 plasma and serum samples, no false-positive reactions were detected using real-time PCR. The data demonstrate the potential to use an internal endogenous sample (IES) using human genes as targets and to judge the presence of human cells in the sample and the accuracy of the sample preparation step.

Об авторах

Список литературы

1. World Health Organization (Hepatitis C) 2023. Available at: https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-c (accessed 17 April 2023).
2. Centers for Disease Control and Prevention (Hepatitis C Surveillance 2020) 2023. Available at: https://www.cdc.gov/hepatitis/statistics/2020surveillance/hepatitis-c.htm (accessed 14 April 2023).
3. Rubric of clinical guidelines (Chronic viral hepatitis C) 2023. Available at: https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/516_2 (accessed 20 April 2023).
4. Jean Dubuisson, François-Loïc C. Virology and cell biology of the hepatitis C virus life cycle – An update. Journal of Hepatology. 2014; 61(1):S3-S13. DOI: 10.1016/j.jhep.2014.06.031.
5. Guoli S., Tetsuro S. Molecular Basis of Encapsidation of Hepatitis C Virus Genome. Frontiers in Microbiology. 2018; 9(396):1-7. DOI: 10.3389/fmicb.2018.00396.
6. Brett D., Charles M. Unravelling hepatitis C virus replication from genome to function. Nature. 2005; 436:933-8. DOI: 10.1038/nature04077.
7. Kalinina O.V., Dmitriev A.V. Structural and functional genome organization and life cycle of Hepatitis C virus. Molekulyarnaya genetika, mikrobiologiya i virusologiya. 2015; 33(2):9-13. (in Russian)
8. Sergio M.B., Charlotte H., Bandita H.P., Robert H., Luisa M.S., Diana M.B. et al. Identification of a Novel Hepatitis C Virus Genotype From Punjab, India: Expanding Classification of Hepatitis C Virus Into 8 Genotypes. The Journal of Infectious Diseases. 2018; 218(11):1722–9. DOI: 10.1093/infdis/jiy401.
9. Pimenov N.N., Komarova S.V., Karandashova I.V., Tsapkova N.N., Volchkova E.V., Chulanov V.P. Hepatitis С and its outcomes in Russia: analysis of incidence, prevalence and mortality rates before the start of the programme of infection elimination. Infektsionnye bolezni. 2018; 16(3):37-45. DOI: 10.20953/1729-9225-2018-3-37-45. (in Russian)
10. CJSC «EKOlab» (PCR diagnostic department — CovidEK Extract). 2023. Available at: https://ekolab.ru/catalog/laboratornaya-diagnostik/otdelenie-ptsr/kovidek-ekstrakt/ (accessed 27 April 2023). (in Russian)
11. Federal Service for Surveillance in Healthcare (Roszdravnadzor): state register of medical devices and organizations (individual entrepreneurs) engaged in the production and manufacture of medical devices (Registration certificate for the medical product «Thermocycler for nucleic acid amplification 1000 with accessories») 2023. Available at: https://www.roszdravnadzor.gov.ru/services/misearch (accessed 12 February 2023). (in Russian)
12. Basic Local Alignment Search Tool 2023. Available at: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (accessed 10 February 2023).
13. Bezrodny S.L., Zhigaleva O.N., Mardanly S.G., Pomazanov V.V., Gashenko T.Yu. Development of a reagent kit for the qualitative detection of SARS-CoV-2 virus RNA in naso- and oropharyngeal swabs by real-time RT-PCR. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika. 2022; 67(11): 663-7. DOI: 10.51620/0869-2084-2022-67-11-663-667. (in Russian)
14. Lida C., Wenli L., Kuo Z., Rui Z., Tian L., Mingju H. et al. Hepatitis C Virus RNA Real-Time Quantitative RT-PCR Method Based on a New Primer Design Strategy. The Journal of Molecular Diagnostics. 2016; 18(1):84-91. DOI: 10.1016/j.jmoldx.2015.07.009.
15. Akanksha S., Dhananjay S.M., Mohammad I. A Single-step multiplex quantitative real time polymerase chain reaction assay for hepatitis C virus genotypes. International Journal of Translational Medicine. 2016; 5(1):34-42.
16. Vaithilingaraja A., Roland R., Vidhya K., Eric Y.S., Tuyet N.Ho, Chang L. et al. High-Resolution Functional Profiling of Hepatitis C Virus Genome. PLoS Pathog. 2008; 4(10):1-16. DOI: 10.1371/journal.ppat.1000182.
17. Zhigaleva O.N., Ermolaev I.I., Mardanly S.G., Gashenko T.Yu., Pomazanov V.V. Development of a reagent kit for the real-time detection of SARS-CoV-2 RNA in naso- and oropharyngeal smears by direct polymerase chain reaction. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika. 2022; 67 (12): 739-43. DOI: 10.51620/0869-2084-2022-67-12-739-743. (in Russian)
18. International Nucleotide Sequence Database Collaboration 2023. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ (accessed 5 April 2023).

Ключевые слова