РАЗРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ ИЗ КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА НА ОСНОВЕ МАГНИТНОЙ АДСОРБЦИИ

Аннотация

В статье рассматриваются этапы разработки набора реагентов для выделения нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) из биологических образцов. Выделенные при помощи разрабатываемого набора ДНК и РНК в дальнейшем могут найти своё применение в проведении амплификации нуклеиновых кислот и детектировании накопления продуктов амплификации методом ПЦР в реальном времени. Описана сфера применений метода полимеразной цепной реакции, его преаналитические этапы; дана краткая характеристика сильных и слабых сторон основных методов выделения нуклеиновых кислот, подробно расписана эффективность метода выделения при помощи магнитного сорбента. Раскрыт поэтапный ход разработки набора: приведено описание этапов протокола выделения нуклеиновых кислот, их корректировка в ходе апробации набора реагентов на разных образцах; описана необходимость грамотного подбора реактивов и магнитного сорбента; представлены данные сравнения результатов экстракции разрабатываемого набора реагентов и коммерческих наборов для выделения нуклеиновых кислот. За время разработки выделялись: ДНК ВГВ, ДНК ИППП, ДНК человека; также выделялись РНК ВГС. Метод выделения разрабатываемого набора – магнитная адсорбция, методы выделения коммерческих наборов, используемых для сравнения результатов – магнитная адсорбция и преципитация. В ходе разработки набора удалось добиться того, что, в конечном счёте, результаты качественного анализа выделений нуклеиновых кислот при помощи разрабатываемого набора и коммерческих наборов совпадают. На основании данных, полученных в ходе объёмной разработки набора для экстракции нуклеиновых кислот, сформулирован вывод о важности правильного выделения ДНК и РНК для их дальнейшей амплификации и регистрации данных.

Annotation

The article is devoted to the development of a set of reagents for the isolation of nucleic acids (DNA and RNA) from biological samples. DNA and RNA isolated using the developed set of DNA and RNA can later find their application in carrying out the amplification of nucleic acids and detecting the accumulation of amplification products by real-time PCR. The scope of application of the polymerase chain reaction method, its preanalytical stages are described; a brief description of the strengths and weaknesses of the main methods for isolating nucleic acids is given, and the effectiveness of the method of isolation using a magnetic sorbent is described in detail. The stage-by-stage development of the kit is disclosed: a description of the stages of the nucleic acid isolation protocol is given, their adjustment during testing of the kit of reagents on different samples; the need for a competent selection of reagents and a magnetic sorbent is described; presents data comparing the results of extraction of the developed set of reagents and commercial kits for the isolation of nucleic acids. During the development, the following were isolated: HBV DNA, STI DNA, human DNA; HCV RNA was also isolated. The extraction method of the developed kit is magnetic sorption, the extraction methods of commercial kits used to compare the results are magnetic sorption and precipitation. During the development of the kit, it was possible to ensure that, ultimately, the results of a qualitative analysis of nucleic acid extracts using the developed kit and commercial kits coincide. Based on the data obtained during the volumetric development of a kit for the extraction of nucleic acids, a conclusion was made about the importance of correct extraction of DNA and RNA for their further amplification and data recording.
Key words: reagent set development; nucleic acids isolation; DNA; RNA; real-time reverse transcription polymerase chain reaction; nucleic acids amplification; extraction; magnetic particles; sample preparation.

Об авторах

Список литературы

1.Oradova A.S. Polymerase chain reaction in laboratory diagnostics. Vestnik Kazakhskogo Natsional’nogo meditsinskogo universiteta. 2013; 1 (4): 306-10. (in Russian)
2.Rebrikov D.V. PCR in real time. Moscow: Laboratoriya znaniy; 2019. (in Russian)
3.Aukenov N.E., Masabaeva M.R., Khasanova U.U. Isolation and purification of nucleic acids. State of the problem at the present stage. Nauka i zdravookhranenie. 2014; 1: 51-3. (in Russian)
4.Zhigaleva O.N., Ermolaev I.I., Mardanly S.G., Gashenko T.Yu., Pomazanov V.V. Development of a kit of reagents for the detection of SARS-CoV-2 virus RNA in naso- and oropharyngeal swabs by real-time direct polymerase chain reaction. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika. 2022; 67(12): 739-43. DOI: 10.51620/0869-2084-2022-67-12-739-743. (in Russian)
5.Bretagne S., Costa J. M. Towards a nucleic acid-based diagnosis in clinical parasitology and mycology. Clin. Chim. Acta. 2006; 363(1-2): 221-8.
6.Tan S. C., Yiap B.C. DNA, RNA, and protein extraction: the past and the present. BioMed Research International. 2009; 2009: 1-10. DOI: 10.1155/2009/574398.
7.Kayumov A.R., Gimadutdinov O.A. Workshop on molecular genetics. Educational-methodical manual. Kazan`: Kazanskiy (Privolzhskiy) federal’nyi universitet; 2016. (in Russian)
8.Lubennikova M.V., Afanasiev V.A., Afanasiev K.A. DNA isolation is an important stage of molecular genetic research. Elektronnyi nauchno-metodicheskiy zhurnal Omskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta imeni P.A.Stolypina. 2020; 21 (2): 4. (in Russian)
9.Mancini N., Carletti S., Ghidoli N., Cichero P., Burioni R., Clementi M. The era of molecular and other non-culture-based methods in diagnosis of sepsis. Clinical microbiology reviews. 2010; 1(23): 235-51.
10.Federal Service for Surveillance in Healthcare: State Register of Medical Devices and Organizations (Individual Entrepreneurs) engaged in the production and manufacture of medical devices (Registration certificate for the medical device «Thermocycler for nucleic acid amplification 1000 with accessories»); 2023. Access mode: https: //www.roszdravnadzor.gov.ru/services/misearch (Accessed July 21, 2023).]. (in Russian)
11.Smith K., Diggle M. A., Clarke S. C. Comparison of commercial DNA extraction kits for extraction of bacterial genomic DNA from whole-blood samples. J. Clin. Microbiol. 2003; 41 (6): 2440-3.

Ключевые слова