РАЗРАБОТКА НАБОРА РЕАГЕНТОВ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА ПЦР ДЛЯ КАЧЕСТВЕННОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ ДНК ВИРУСА ГЕПАТИТА B

Аннотация

Вирус гепатита В (HBV) наряду с другими вирусными гепатитами является распространенным возбудителем и опасным инфекционным агентом среди тех, которые вызывают заболевания печени у людей, он определен как одна из основных глобальных проблем здравоохранения не только в России, Европе, но и во всем мире. С момента открытия вируса гепатита B было инфицировано примерно 400 миллионов человек во всем мире; цирроз и гепатоцеллюлярная карцинома, основные последствия хронического гепатита В, приводящие к более полумиллиона смертей в год. В 2016 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) поставила амбициозную цель ликвидировать вирусный гепатит, как основную глобальную угрозу общественному здравоохранению к 2030 году. Виремия HBV является важнейшим фактором риска прогрессирования хронической HBV-инфекции, в связи с этим направлены поиски на новые методы обнаружения вируса гепатита B наряду с хорошо зарекомендовавшими себя иммунологическими методами. Качественное выявление ДНК HBV в крови методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) стало важнейшим инструментом в оценке и лечении инфекции. В статье приводится описание разработки набора реагентов для выявления вируса HBV методом ПЦР. Диагностическая чувствительность и специфичность разрабатываемого набора составляет 100 %, такие результаты были получены на пробах от 200 пациентов с подтверждённым и отрицательным результатом по HBV. По анализу литературных данных показано, что скорость мутаций в геноме для HBV выше, чем для большинства ДНК-вирусов. В связи с этим областью для посадки праймеров послужил ген POL, после выравнивания последовательностей генотипов HBV, в том числе с приобретенными мутациями. Включенный в набор эндогенный внутренний контроль, нацеленный на ген человека (бета-глобулин), позволит судить о реальном наличии клеток человека в образце и правильности проведения этапа пробоподготовки.

Annotation

Hepatitis B virus (HBV) along with other viral hepatitis is a common pathogen and dangerous infectious agent among those that cause liver disease in humans, it is identified as one of the major global health problems not only in Russia, Europe, but also worldwide. Since its discovery, the hepatitis B virus has infected approximately 400 million people worldwide; cirrhosis and hepatocellular carcinoma, the main consequences of chronic hepatitis B, leading to more than half a million deaths per year. In 2016, the World Health Organization (WHO) set an ambitious goal to eliminate viral hepatitis as a major global public health threat by 2030. HBV viremia is a critical risk factor for the progression of chronic HBV infection, and new methods for detecting hepatitis B virus, alongside well-established immunological methods, are being sought. Qualitative detection of HBV DNA in blood by polymerase chain reaction (PCR) has become an essential tool in evaluation and treatment of infection. This article describes the development of a reagent kit for the detection of HBV by PCR. Diagnostic sensitivity and specificity of the developed kit is 100%, these results were obtained on samples from 200 patients with confirmed and negative HBV results. A review of the literature shows that the mutation rate in the genome for HBV is higher than for most DNA viruses. In this regard, the POL gene was used as the region for primer seeding, after alignment of HBV genotypes, including those with acquired mutations. The endogenous internal control included in the kit, targeting the human gene (beta-globulin), will judge the actual presence of human cells in the sample and the correctness of the sample preparation step.
Key words: hepatitis B virus (HBV); real-time polymerase chain reaction (PCR-RT); PCS; IES; primers; detection; kit development.

Об авторах

Список литературы

1.Rubric of clinical guidelines (Acute hepatitis B (HB) in adults) 2023. Available at: https://cr.minzdrav.gov.ru/schema/672_1 (2 мay 2023). (in Russian)
2.World Health Organization (Hepatitis B) 2023. Available at: https://www.who.int/ru/news-room/fact-sheets/detail/hepatitis-b (2 мay 2023). (in Russian)
3.Federal State Statistics Service (Rosstat) 2023. Available at: https://eng.rosstat.gov.ru/search?q=incidence+of+hepatitis+&date_from=&content=on&date_to=&search_by=all&sort=relevance (7 may 2023). (in Russian)
4.Liang T. J. Hepatitis B: the virus and disease. Hepatology. 2009; 49(5): S13–S21. DOI: 10.1002/hep.22881.
5.Venkatakrishnan B., Zlotnick A. The Structural Biology of Hepatitis B Virus: Form and Function. Annual review of virology. 2016; 3(1): 429–51. DOI: 10.1146/annurev-virology-110615-042238.
6.Zhao K., Liu A., Xia Y. Insights into Hepatitis B Virus DNA Integration-55 Years after Virus Discovery. The Innovation. 2020; 1(2): 1-10. DOI: 10.1016/j.xinn.2020.100034.
7.Ho J. K., Jeevan-Raj B., Netter H. J. Hepatitis B Virus (HBV) Subviral Particles as Protective Vaccines and Vaccine Platforms. Viruses. 2020; 12(2): 1-26. DOI: 10.3390/v12020126.
8.Zehender G., Ebranati E., Gabanelli E., Sorrentin, C., Lo Presti A., Tanzi E. et al. Enigmatic origin of hepatitis B virus: an ancient travelling companion or a recent encounter?. World journal of gastroenterology. 2014; 20(24): 7622–34. DOI: 10.3748/wjg.v20.i24.7622.
9.Spitz N., Mello F. C. A., Moreira A. S., Gusatti C. S., Martins R. M. B., Gomes S. A. et al. Reconstruction of the spatial and temporal dynamics of hepatitis B virus genotype D in the Americas. PloS One. 2019; 14(7): 1-20. DOI: 10.1371/journal.pone.0220342.
10.Araujo N.M., Teles S.A., Spitz N. Comprehensive analysis of clinically significant hepatitis B virus mutations in relation to genotype, subgenotype and geographic region. Frontiers in microbiology. 2020; 11: 1-22. DOI: 10.3389/fmicb.2020.616023.
11.Ivashkin V.T., Yushchuk N.D., Maevskaya M.V., Znoyko O.O., Dudina K.R., Karetkina G.N. et al. Clinical guidelines of the Russian Gastroenterological Association and the Russian Society for the Study of the Liver on the diagnosis and treatment of adult patients with hepatitis B. Rossiyskiy zhurnal gastroenterologii, gepatologii, koloproktologii. 2014; 3: 58-88. (in Russian)
12.Sunbul M. Hepatitis B virus genotypes: global distribution and clinical importance. World journal of gastroenterology. 2014; 20(18):5427–34. DOI: 10.3748/wjg.v20.i18.5427.
13.Wu B., Xiao F., Li P., Du Y., Lin J., Ming K. et al. Ultrasensitive detection of serum hepatitis B virus by coupling ultrafiltration DNA extraction with real-time PCR. PLoS One. 2017; 12(2): 1-14. DOI: 10.1371/journal.pone.0170290.
14.Wang S., Li H., Ko Z., Ren F., Jin Y., Yang L. et al. Highly sensitive and specific detection of hepatitis B virus DNA and drug resistance mutations utilizing the PCR-based CRISPR-Cas13a system. Clinical Microbiology and Infection. 2021; 27(3): 443–50. DOI: 10.1016/j. cmi.2020.04.018.
15.CJSC «EKOlab» (PCR diagnostic department — CovidEK Extract); 2023. Available at: https://ekolab.ru/catalog/laboratornaya-diagnostik/otdelenie-ptsr/kovidek-ekstrakt/ (accessed 4 May 2023). (in Russian)
16.Basic Local Alignment Search Tool 2023. Available at: https://blast. ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi (accessed 30 April 2023).
17.Zhigaleva O.N., Mardanly S.G., Gashenko T.Yu., Ermolaev I.I. Development of a reagent kit for the quantitative determination of hepatitis B virus (HBV) DNA in clinical material by PCR with hybridization-fluorescence detection. Epidemiologiya I vaktsinoprofilaktika. 2023; 22(4): 86-93. DOI: 10.31631/2073-3046-2023-22-4-86-94. (in Russian)
18.Portilho M. M., Mendonça A. C. D. F., Bezerra C. S., do Espirito-Santo M. P., de Paula V. S., Nabuco L. C. et al. Usefulness of in-house real time PCR for HBV DNA quantification in serum and oral fluid samples. Journal of virological methods. 2018; 256: 100–6. DOI: 10.1016/j.jviromet.2018.03.001.
19.Naito H., Hayashi S., Abe K. Rapid and specific genotyping system for hepatitis B virus corresponding to six major genotypes by PCR using type-specific primers. Journal of clinical microbiology. 2001; 39(1): 362–4. DOI: 10.1128/JCM.39.1.362-364.2001.
20.Ding L., Rui C., Zhansheng J., Xiangling W., Pin, L., Zhen Y. et al. Detection of hepatitis B virus genotypes A to D by the fluorescence polarization assay based on asymmetric PCR. Journal of virological methods. 2010; 168(1-2): 31–7. DOI: 10.1016/j.jviromet.2010.04.011.
21.Zhigaleva O.N., Ermolaev I.I., Mardanly S.G., Gashenko T.Yu. Development of the reagent kit for qualitative realtime detection of HIV-1 RNA by polymerase chain reaction. Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika. 2023; 68 (5): 298-304. DOI: 10.51620/0869-2084-2023-68-5-298-304. (in Russian)
22.International Nucleotide Sequence Database Collaboration; 2023. Available at: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ (accessed 8 May 2023).

Ключевые слова