Аннотация
Определение длины теломер может проводиться методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяя получить абсолютную длину теломер (АДТ), выраженную в количестве пар нуклеотидов, и с помощью проточной цитометрии, которая может оценить только относительный показатель длины теломер. Целью исследования было сопоставить результаты двух методов и разработать точный и надежный способ перевода относительной длины теломер в абсолютную. Материалом для исследования служила периферическая кровь от 21 донора. Измерение длины теломер лейкоцитов методом проточной цитометрии проводили с помощью коммерческого набора Telomere PNA Kit/FITC (Dako, Дания) на двух проточных цитометрах CytoFLEX (Beckman Coulter, КНР) и BD FACSCanto II (Becton Dickinson, США), получая молекулярный эквивалент флуоресценции (МЭФ). Для измерения длины теломер методом ПЦР в режиме реального времени получали калибраторы с известным числом теломерных повторов. Проводили две количественных ПЦР: одну — для теломерных повторов, другую — для определения количества геном-эквивалентов ДНК, трижды для каждого образца, что позволяло рассчитать АДТ. Обнаружена сильная прямая связь между МЭФ, полученными при анализе проб на BD FACSCanto II и CytoFLEX (r = 0,97). При корреляционном анализе результатов ПЦР и проточной цитометрии была обнаружена значимая взаимосвязь между АДТ и МЭФ. Мы рассчитали уравнения регрессии АДТ от МЭФ для CytoFLEX — y = 0,0043x (r = 0,84) и для BD FACSCanto II — y = 0,0051x (r = 0,82). Проведенный корреляционный анализ показал высокую сопоставимость результатов определения длины теломер двумя методами. Полученные уравнения регрессии позволяют перевести результаты проточной цитометрии в абсолютные показатели, позволяя сравнивать результаты разных исследовательских групп и применять этот метод в клинических исследованиях.
Список литературы
Blackburn E.H., Greider C.W., Szostak J.W. Telomeres and telomerase: The path from maize, Tetrahymena and yeast to human cancer and aging. Nat. Med. 2006;12(10):1133-8.
Palm W., De Lange T. How shelterin protects mammalian telomeres. Annu Rev Genet. 2008;42:301-34.
Levy M.Z., Allsopp R.C., Futcher A.B., Greider C.W., Harley C.B. Telomere end-replication problem and cell aging. J. Mol. Biol. 1992;225(4):951-60.
Blackburn E.H. Telomere states and cell fates. Nature. 2000;408(6808):53-6.
Hayflick L. The limited in vitro lifetime of human diploid cell strains. Exp. Cell Res. 1965;37(3):614-36.
Богданов А. Теломеры и теломераза. Соросовский образовательный журнал. 1998;(12):12-8.
Егоров Е.Е. Теломеры, теломераза, канцерогенез и мера здоровья. Клиническая онкогематология Фундаментальные исследования и клиническая практика. 2010;3(2):184-95.
Blackburn E.H. Switching and signaling at the telomere. Cell. 2001;106(6):661-73.
Greider C.W. Telomere Length Regulation. Annu Rev. Biochem. 1996;65(1):337-65.
Calado R.T, Young N.S. Mechanisms of disease: Telomere diseases. N. Engl.J. Med. 2009;361(24): 2353-65.
Демина И.А., Овсянникова Г.С., Калинина И.И., Сунцова Е.В., Горонкова О.В., Райкина Е.В. и др. Значение длины теломер для индивидуализации терапии апластической анемии. Педиатрия Журнал им ГН Сперанского. 2017;96(5):97-103.
Кулагин А.Д., Борисов В.И., Пронкина Н.В., Лисуков И.А., Козлов В.А., Афанасьев Б.В. Частота и прогностическое значение укорочения теломерных участков ДНК при апластической анемии. Гематология и трансфузиология. 2014;59(S1):20.
Engelhardt M., Mackenzie K., Drullinsky P.R., Silver R.T., Moore M.A.S. Telomerase activity and telomere length in acute and chronic leukemia, pre- and post-ex vivo culture. Cancer Res. 2000;60(3):610-7.
Cottliar A., Pedrazzini E., Corrado C., Engelberger M.I., Narbaitz M., Slavutsky I. Telomere shortening in patients with plasma cell disorders. Eur. J. Haematol. 2003;71(5):334-40.
Boultwood J., Fidler C., Kusec R., Rack K., Elliott P.J.W., Atoyebi O., et al. Telomere length in myelodysplastic syndromes. Am J Hematol. 1997;56(4):266-71.
Kim N.W., Piatyszek M.A., Prowse K.R., Harley C.B., West M.D., Ho P.L., et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science. 1994;266(5193):2011-5.
Gutierrez-Rodrigues F., Santana-Lemos B.A., Scheucher P.S., Alves-Paiva R.M., Calado R.T. Direct comparison of Flow-FISH and qPCR as diagnostic tests for telomere length measurement in humans. PLoS One. 2014;9(11):e113747.
Борисов В.И., Демаков С.А., Непомнящих В.М., Леонова М.И., Демина Д.В., Баровская Н.А. и др. Особенности изменения средней длины теломер в лимфоцитах у больных бронхиальной астмой. Медицинская иммунология. 2009;11(6):523-30
Baerlocher G.M., Mak J., Tien T., Lansdorp P.M. Telomere length measurement by fluorescence in situ hybridization and flow cytometry: Tips and pitfalls. Cytometry. 2002;47(2):89-99.
Law H.K.W., Lau Y.L. Validation and development of quantitative flow cytometry-based fluorescence in situ hybridization for intercenter comparison of telomere length measurement. Cytometry. 2001;43(2):150-3.
Gil M.E., Coetzer T.L. Real-time quantitative PCR of telomere length. Appl. Biochem. Biotechnol. — Part B Mol. Biotechnol. 2004;27(2):169-72.
O’Callaghan N.J., Dhillon V.S., Thomas P., Fenech M. A quantitative real-time PCR method for absolute telomere length. Biotechniques. 2008;44(6):807-9.
Rufer N., Dragowska W., Thornbury G., Roosnek E., Lansdorp P.M. Telomere length dynamics in human lymphocyte subpopulations measured by flow cytometry. Nat. Biotechnol. 1998;16(8):743-7.
Борисов В.И., Кожевников В.С., Сенюков В.В., Сизиков А.Э., Коненкова Л.П., Герцог О.А. и др. Укорочение длины теломер моноцитов при ревматоидном артрите. Медицинская иммунология. 2006;8(1):87-90
Cawthon R.M. Telomere length measurement by a novel monochrome multiplex quantitative PCR method. Nucleic Acids Res. 2009;37(3):e21
Дёмина А.И., Семченкова А.А., Кагирова З.Р., Попов А.М. Измерение абсолютной длины теломер методом проточной цитометрии. Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии. 2018; 17 (4): 66-72
Wynn R.F., Cross M.A., Hatton C., Will A.M., Lashford L.S., Dexter T.M., et al. Accelerated telomere shortening in young recipients of allogeneic bone-marrow transplants. Lancet. 1998;351(9097):178-81.
Zimmermann S., Glaser S., Ketteler R., Waller C.F., Klingmüller U., Martens U.M. Effects of telomerase modulation in human hematopoietic progenitor cells. Stem. Cells. 2004;22(5):741-9.
Graham M.K., Meeker A. Telomeres and telomerase in prostate cancer development and therapy. Nat.Rev. Urol. 2017;14(10): 2607-19.
Heaphy C.M., Meeker A.K. The potential utility of telomere-related markers for cancer diagnosis. J. Cell Mol.Med. 2011;15(6):1227-38.