СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ МЕТОДОВ LAMP И ПЦР-РВ ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА

Аннотация

Представлены результаты выявления ДНК штаммов Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei с помощью петлевой изотермической амплификации (LAMP) и ПЦР с детекцией продукта в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Показано, что в ПЦР-РВ праймеры надежно выявляли ДНК тех микроорганизмов, к последовательностям которых они были сконструированы. ДНК гетерологичных штаммов указанные праймеры не выявляли. При проведении LAMP ни один набор праймеров не показал высокой аналитической чувствительности и специфичности. Праймеры выявляли ДНК не всех исследованных штаммов, к генам-мишеням которых они были рассчитаны, но были способны направлять синтез фрагментов генов гетерологичных штаммов. При этом результаты повторных экспериментов плохо воспроизводились. Неудачи при проведении LAMP могут быть обусловлены наличием GC-богатых областей в геноме Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei и формированием вторичных структур в изотермических условиях. B случае таких сложных для LAMP матриц, как ДНК Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei, рекомендуется использовать ПЦР-РВ для детекции возбудителей.

Об авторах

Список литературы

Neubauer H., Sprague L.D., Zacharia R., Tomaso H., Al Dahouk S., Wernery R. et al. Serodiagnosis of Burkholderia mallei infections in horses: state-of-the-art and perspectives. J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health. 2005; 52:201-5.

Van Zandt K.E., Greer M.T., Gelhaus H.C. Glanders: an overview of infection in humans. Orphanet J. Rare Dis. 2013; 8:131.

Dance D.A. Melioidosis as an emerging global problem. Acta Trop. 2000; 74:115-9.

Cheng A.C., Currie B.J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management. Clin. Microbiol. Rev. 2005; 18:383-416.

Currie B.J., Fisher D.A., Howard D.M., Burrow J.N., Lo D., Selva-Nayagam S. et al. Endemic melioidosis in tropical northern Australia: a 10-year prospective study and review of the literature. Clin. Infect. Dis. 2000; 31:981-6.

Chaowagul W., White N.J., Dance D.A., Wattanagoon Y., Naigowit P., Davis T.M. et al. Melioidosis: amajor cause of community-acquired septicemia in northeastern Thailand. J. Infect. Dis. 1989; 159:890-9.

Dance D.A. Melioidosis: the tip of the iceberg? Clin. Microbiol. Rev. 1991; 4:52-60.

Sanford J.P. Pseudomonas species (including melioidosis and glanders) In: Mandell G.L., Bennett J.E., Dolin R., ed. Principles and practice of infectious diseases. 8th ed. New York, N.Y: Churchill Livingstone; 1995; 2003-9.

HHS and USDA Select Agents and Toxins 7 CFR Part 331, 9 CFR Part 121, 42 CFR Part 73. 2012. https://www.selectagents.gov/resources/List_of_Select_Agents_and_Toxins_2012-12-4.pdf. Accessed 1 February 2012.

Tomaso H., Scholz H.C., Al Dahouk S., Pitt T.L., Treu T.M., Neubauer H. Development of 5′ nuclease real-time PCR assays for the rapid identification of the Burkholderia mallei/Burkholderia pseudomallei complex. Diagn. Mol. Pathol. 2004; 13:247-53.

Tomaso H., Scholz H.C., Al Dahouk S., Eickhoff M., Treu T.M., Wernery R. et al. Development of a 5’-nuclease real-time PCR assay targeting fliP for the rapid identification of Burkholderia mallei in clinical samples. Clin. Chem. 2006; 52(2):307-10.

Lee M.A., Wang D., Yap E.H. Detection and differentiation of Burkholderia pseudomallei, Burkholderia mallei and Burkholderia thailandensis by multiplex PCR. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005; 43:413-7.

Janse I., Hamidjaja R.A., Hendriks A.C., van Rotterdam B.J. Multiplex qPCR for reliable detection and differentiation of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei. BMC Infect. Dis. 2013; 13:86.

Notomi T., Okayama H., Masubuchi H., Yonekawa T., Watanabe K., Amino N. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000; 28:E63.

Notomi T., Hase T. Process for synthesizing nucleic acid, 2002, US patent 6410278.

Mirzai S., Safi S., Mossavari N., Afshar D., Bolourchian M. Development of a loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Burkholderia mallei. Cell Mol. Biol. Noisy-le-grand). 2016; 62(10):32-6.

Pal V., Saxena A., Singh S., Goel A.K., Kumar J.S., Parida M.M. et al. Development of a real-time loop-mediated isothermal amplification assay for detection of Burkholderia mallei. Transbound Emerg. Dis. 2017; 65(1):e32-e39.

Chantratita N., Meumann E., Thanwisai A., Limmathurotsakul D., Wuthiekanun V., Wannapasni S. et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Method Targeting the TTS1 Gene Cluster for Detection of Burkholderia pseudomallei and Diagnosis of Melioidosis. J. Clin. Microbiol. 2008; 46(2):568-73.

Ignatov K.B., Barsova E.V., Fradkov A.F., Blagodatskich K.A., Kramarova T.V., Kramarov V.M. A strong strand displacement activity of thermostable DNA polymerase markedly improves the results of DNA amplification. BioTechniques. 2014; 57:81-7.

Nierman W.C., DeShazer D., Kim H.S., Tettelin Н., Nelson K.E., Feldblyum T. et al. Structural flexibility in the Burkholderia mallei genome. Proc. Nat. Acad. Sciences USA. 2004; 101(39):14246-51.

Gilling D.H., Luna V.A., Pflugradt C. The Identification and Differentiation between Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei Using One Gene Pyrosequencing. International Scholarly Research Notices. 2014, Article ID 109583.

Rees W.A., Korte Y.T., Von J., Hippel P.H. Betaine can eliminate the base pair composition dependence of DNA melting. Biochemistry. 1993; 32(1): 137-44.

Henke W., Herdel K., Jung K., Schnorr D., Loening S. A. Betaine improves the PCR amplification of GC-rich DNA sequences. Nucl. Acids Res. 1997; 25(19): 3957-8.

Jensen M.A., Fukushima M., Davis R. DMSO and Betaine greatly improve amplification of GC-rich constructs in De Novo synthesis. PLoS ONE. 2010; 5(6):e11.

Parida M., Sannarangaiah S., Dash P.K., Rao P.V.L., Morita K. Loop mediated isothermal amplification (LAMP): a new generation of innovative gene amplification technique; perspectives in clinical diagnosis of infectious diseases. Rev. Med. Virol. 2008; 18:407-21.

Щит И.Ю., Игнатов К.Б., Кудрявцева Т.Ю., Шишкова Н.А., Миронова Р.И., Маринин Л.И., Мокриевич А.Н., Крамаров В.М., Бикетов С.Ф., Дятлов И.А. Использование петлевой изотермической амплификации ДНК для выявления и идентификации сибиреязвенного микроба. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2017. 35(2):69-76

George G.,Mony P., Kenneth J. Comparison of the efficacies of loop-mediated isothermal amplification, fluorescence smear microscopy and culture for the diagnosis of tuberculosis. PloS ONE. 2011; 6:e21007.

Chen S.Y., Wang F., Beaulieu J.C., Stein R.E., Ge B.L. Rapid detection of viable salmonellae in produce by coupling propidium monoazide with loopmediated isothermal amplification. Appl. Environ. Microbiol. 2011; 77:4008-16.

Tomita N., Mori Y., Kea H., Notomi T. Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) of Gene Sequences and Simple Visual Detection of Products. Nature Protocols. 2008; 3:877-82.

Ключевые слова