Валидация метода для оценки содержания в крови Т-клеток памяти к белку нуклеокапсида вируса SARS-CoV-2, продуцирующих IFN-γ при антигенной стимуляции in vitro

Аннотация

Актуальность. В начале пандемии COVID-19 основное внимание было сосредоточено на формировании вирус-нейтрализующих антител против spike (S)-белка вируса и Т-клеток, распознающих S-белок, как на основном защитном механизме. Поскольку SARS-CoV-2 — быстро мутирующий вирус, постепенно возросло внимание к белку нуклеокапсида (N-белку), более консервативному в генетическом отношении, и иммунитету против него.
Цель работы — модифицировать запатентованный нами ранее метод для выявления Т-клеточной памяти к N-белку SARS-CoV-2, оценить его чувствительность и специфичность и возможность введения полуколичественной оценки.
Материал и методы. Валидация метода проведена на образцах крови офисных работников в 2024-2025 годах в г. Москве. Всего использованы 90 образцов крови взрослых добровольцев, у которых в ходе иммунизации вакциной Спутник V и ПЦР-подтвержденного заболевания COVID-19 в 2021-2023 гг. сформировался гибридный иммунитет против коронавируса SARS-CoV-2. Группа отрицательного контроля представлена 13 детьми в возрасте 6 месяцев — 2 лет, не имевших в анамнезе и на момент обследования ПЦР-подтвержденной SARS-CoV-2- инфекции.
Антитела к S-гликопротеину SARS-CoV-2 класса IgG и класса IgM к S-гликопротеину и N(nuclear)-белку в сыворотке крови определяли методом ИФА с помощью тест-систем АО «Вектор-Бест», (Россия), а также тест-систем N-Cov-2-IgG PS (Институт Пастера, Россия). Для выявления Т-клеток памяти против S- или N-белка SARS-CoV-2 использовался собственный метод (Патент RU 2 780 369 C1), при котором те же ИФА наборы использовались как источник антигенов для стимуляции лимфоцитов, выделяемых из крови. После 72-часовой антигенной стимуляции собирали супернатанты и определяли в них концентрацию IFN-γ, являющегося продуктом активации Т-клеток памяти.
Результаты. Определены границы для полуколичественой оценки сохранения Т-клеточной памяти против N-белка SARS-CoV-2. Низкая активность этих клеток при стимуляции N-белком in vitro выражается продукцией IFN-γ от 50 до 100 пг/мл, нормальная – 100-700 пг/мл, высокая – выше 700 пг/мл. Корреляция между величиной показателей специфического Т-клеточного и гуморального иммунитета против этого антигена у здоровых людей через 0,5-2 года после перенесенного заболевания в данной выборке слабая (RS=0,12). Однако, у лиц с высокой активностью Т-клеток памяти против N-белка, уровень антител к этому антигену в крови также высок, а у лиц, не контактировавших с вирусом, не обнаружены ни антитела, ни Т-клетки. Специфичность метода оценена с помощью ROC-анализа (AUC= 0,82, р = 0,0015).
Заключение. Разработанный нами методический подход пригоден для определения активности Т-клеток памяти не только к S-белку, но и к N-белку SARS-CoV-2. Определение напряженности специфического Т-клеточного иммунитета в группах риска перед началом эпидсезона может дать прогноз заболеваемости в данной популяции.

Annotation

Relevance. At the beginning of the COVID-19 pandemic, the primary focus was on the formation of virus-neutralizing antibodies against the spike (S) protein and S-specific T cells as the main protective mechanism. Since SARS-CoV-2 is a rapidly mutating virus, attention gradually shifted to the nucleocapsid (N) protein, which is more genetically conserved, and the immune response against it.
Objective. Modify our previously patented method for detecting T-cell memory for the SARS-CoV-2 N-protein, to evaluate its sensitivity and specificity, and the possibility of introducing a semi-quantitative assessment.
Material and methods. The method was validated using blood samples from office workers in Moscow in 2024–2025. A total of 90 blood samples from adult volunteers with hybrid immunity (developed after Sputnik vaccination and PCR-confirmed COVID-19 in 2021–2023) were used. The negative control group consisted of 13 children aged 6 months to 2 years with no history of PCR-confirmed SARS-CoV-2 infection.
Anti-S IgG and anti-N IgM/IgG antibodies in serum were detected by ELISA (Vector-Best, Russia, and N-Cov-2-IgG PS, Pasteur Institute, Russia). Memory T cells against S or N protein were identified using our patented method (RU Patent 2,780,369 C1), where ELISA kits served as antigen sources for lymphocyte stimulation. After 72-hour antigen stimulation, supernatants were collected, and IFN-γ (a marker of memory T-cell activation) was quantified.
Results. Thresholds for semi-quantitative assessment of N-specific memory T cells were established: low activity (IFN-γ: 50–100 pg/mL), normal (100–700 pg/mL), and high (>700 pg/mL). The correlation between T-cell and humoral immunity against N-protein in healthy individuals 0.5–2 years post-infection was weak (RS=0.12). However, subjects with high N-specific T-cell activity also had high anti-N antibody levels, while virus-naïve individuals showed neither. ROC analysis confirmed method specificity (AUC=0.82, p=0.0015).
Conclusion. Our method is suitable for assessing memory T-cell activity against both S and N proteins. Measuring T-cell immunity in high-risk groups before epidemic seasons may help predict disease incidence.
Key words: SARS-CoV-2; memory T-cells; semi-quantitative assessment; IFN-γ; nucleocapsid (N) protein; spike (S) protein

Об авторах

Список литературы

ЛИТЕРАТУРА (пп. 1-3, 7-10,13, 14 см. REFERENCES)

4. Алешкин А.В., Новикова Л.И., Бочкарева С.С., Комбарова С.Ю., Лебедин Ю.С., Воробьев А.М., Мехтиев Э.Р.О., Зулькарнеев Э.Р., Лаишевцев А.И., Караулов А.В. Алешкин А.В., Динамика антител к различным антигенам коронавируса SARS-COV-2 у больных с подтверждённой инфекцией COVID-19. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2021; 171(2): 196-9. DOI: 10.47056/0365-9615-2021-171-2-196-199.
5. Дуванова О. В., Чемисова О. С., Носков А. К. Структурные белки SArS-CoV-2. Медицинский вестник Юга России. 2022; 13(4): 45-52. DOI: 10.21886/2219-8075-2022-13-4-45-52.
6. Костинов М.П., Тюкавкина С.Ю., Харсеева Г.Г., Миронов А.Ю., Каушанская Л.В., Муслимова З.А. Клиническая лабораторная диагностика, иммунопатогенез, иммунокоррекция при COVID-19 (обзор литературы). Клиническая лабораторная диагностика. 2024; 69 (9): 456-67. DOI: 10.51620/0869-2084-2024-69-9-456-467 .
11. Стрижакова О.М., Першин А.С., Казаров А.А., Лягоскин И.В., Бахарева Я.А., Васильев А.П., Никонова Ю.А., Егорова И.Ю., Шукуров Р.Р., Хамитов Р.А. Оптимизация и валидация количественного метода оценки реактивности Т-клеток памяти человека к антигенам вируса SARS-CoV-2 с использованием проточной цитометрии. Инфекция и иммунитет. 2023; 13(4): 642–52. DOI: 10.15789/2220- 7619-OAV-2084.
12. Бляхер М.С., Федорова И.М., Тульская Е.А., Капустин И.В., Котелева С.И., Рамазанова З.К., Одинцов Е.Е., Сандалова С.В., Новикова Л.И. Определение специфического Т-клеточного иммунитета к антигенам вируса SARS-COV-2 у людей, переболевших COVID-19. Вопросы вирусологии. 2022; 67(6): 527-37. DOI: 10.36233/0507-4088-151.
15. Потеряев Д.А., Аббасова С.Г., Игнатьева П.Е., Стрижакова О.М., Колесник С.В., Хамитов Р.А. Оценка Т-клеточного иммунитета к SARS-CoV-2 у переболевших и вакцинированных против COVID-19 лиц с помощью ELISPOT набора ТиграТест® SARS-CoV-2. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. 2021;21(3):178-92. DOI: 10.30895/2221-996X-2021-21-3-178-192.
16. Бляхер М.С., Федорова И.М., Котелева С.И., Капустин И.В., Тульская Е.А., Рамазанова З.К. и др. Алгоритм оценки уровня Т-клеточного иммунного ответа против SARS-CoV-2 и результаты его применения у не вакцинированных и вакцинированных людей, переболевших COVID-19. Инфекция и иммунитет. 2024; 14(3): 451-8. DOI: 10.15789/2220-7619-AFA-16736.

REFERENCES
1. Notarbartolo S. T-cell immune responses to SARS-CoV-2 infection and vaccination Vaccines (Basel). 2024; 12(10): 1126. DOI: 10.3390/vaccines12101126.
2. Sallusto F. Heterogeneity of human CD4(+) T cells against microbes. Annu. Rev. Immunol. 2016; 20(34): 317-34. DOI: 10.1146/annurev-immunol-032414-112056.
3. Verhoeven D., Teijaro J.R., Farber D.L. Heterogeneous memory Т cells in antiviral immunity and immunopathology. Viral Immunology. 2008; 21(2): 99–113. DOI: 10.1089/vim.2008.0002.
4. Aleshkin A.V., Novikova L.I., Bochkareva S.S., Kombarova S.Y., Vorob’ev A.M., Mekhtiev E.R., Karaulov A.V., Zul’karneev E.R., Laishevtsev A.I., Lebedin Y.S. Dynamics of antibodies to various antigens of the SARS-COV-2 coronavirus in patients with confirmed COVID-19 infection. Bulleten`eksperimental`noy biologii i meditsiny. 2021; 171(2): 196-9. DOI: 10.47056/0365-9615-2021-171-2-196-199. (in Russian)
5. Duvanova O.V., Chemisova O.S., Noskov A.K. Structural proteins of SArS-CoV-2. Meditsinskiy vestnik Yuga Rossii. 2022; 13(4): 45-52. DOI: 10.21886/2219-8075-2022-13-4-45-52. (in Russian)
6. Kostinov M.P., Tyukavkina S.Y., Kharseeva G.G., Mironov A.Yu., Kaushanskaya L.V., Muslimova Z.A. Clinical laboratory diagnostics, immunopathogenesis, immunocorrection in COVID-19 (review of literature). Klinicheskaya Laboratornaya Diagnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2024; 69 (9): 456-67. DOI: 10.51620/0869-2084-2024-69-9-456-467. (in Russian)
7. Song W., Fang Z., Ma F., Li J., Huang Z., Zhang Y., Li J., Chen K. The role of SARS-CoV-2 N protein in diagnosis and vaccination in the context of emerging variants: present status and prospects. Front. Microbiol. 2023; 14(14): 1217567. DOI: 10.3389/fmicb.2023.1217567.
8. Lv H., Shi F., Yin H., Jiao Y., Wei P. Development of a double-antibody sandwich ELISA for detection of SARS-CoV-2 variants based on nucleocapsid protein-specific antibodies. Microbiol. Immunol. 2024; 68(11): 393-8. DOI: 10.1111/1348-0421.13173.
9. Weigl N., Pleimelding C., Gilberg L., Huynh D., Brand I., Bruger J. et al. Detectable SARS-CoV-2 specific immune responses in recovered unvaccinated individuals 250 days post wild type infection. PLoS One. 2025; 20(6): e0325923. DOI: 10.1371/journal.pone.0325923.
10. Files M.A, Gentles L., Kehoe L., Adler A., Lacombe K., Dickerson J.A. et al. Kinetics and durability of antibody and T-cell responses to SARS-CoV-2 in children. J. Infect. Dis. 2024; 230(4): 889-900. DOI: 10.1093/infdis/jiae301.
11. Strizhakova O.M., Pershin A.S., Kazarov A.A., Lyagoskin I.V., Bahareva Y.A., Vasil’ev A.P. et al. Optimization and validation of flow cytometry method for quantification of SARS-CoV-2 antigen-reactive human memory T cells. Infektsiya i immunitet. 2023; 13(4): 642-52. DOI: 10.15789/2220-7619-OAV-2084. (in Russian)
12. Blyakher M.S., Fedorova I.M., Tulskaya E.A., Kapustin I.V., Koteleva S.I., Ramazanova Z.K. Odintsov E.E., Sandalova S.V., Novikova L.I. Assesment of specific T-cell immunity to SARS-CoV-2 virus antigens in COVID-19 reconvalescents. Voprosy virusologii. 2022; 67(6): 527-37. DOI: 10.36233/0507-4088-151. (in Russian)
13. https://roszdravnadzor.gov.ru/i/upload/images/2021/7/7/1625616749.35705-1-141305.pdf?ysclid=mcugwbtg2d168851684.
14. Dourdouna M.M., Tatsi E.B., Syriopoulou V., Michos A. Evaluation of T cell responses with the QuantiFERON SARS-CoV-2 assay in individuals with 3 doses of BNT162b2 vaccine, SARS-CoV-2 infection, or hybrid immunity. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2023; 106(3):115948. DOI: 10.1016/j.diagmicrobio.2023.115948.
15. Poteryaev D.A., Abbasova S.G., Ignatyeva P.E., Strizhakova O.M., Kolesnik S.V., Khamitov R.A. Assessment of T-cell immunity to SARS-CoV-2 in COVID-19 convalescents and vaccinated subjects, using TigraTest® SARS-CoV-2 ELISPOT kit. BIOpreparations. Prevention, Diagnosis, Treatment. 2021; 21(3):178-92. DOI: 10.30895/2221-996X-2021-21-3-178-192. (in Russian)
16. Blyakher M.S., Fedorova I.M., Koteleva S.I., Kapustin I.V., Tulskaya E.A., Ramazanova Z.K., Odintsov E.E., Sandalova S.V., Novikova L.I., Bochkareva S.S. Algorithm for assessing the level of T cell immune response against SARS-CoV-2 and the results of its application in unvaccinated and vaccinated people who have been infected with COVID-19. Infektsiya i immunitet. 2024; 14(3): 451-8. DOI: 10.15789/2220-7619-AFA-16736. (in Russian)

Ключевые слова