Разработка и сравнительная апробация методик для повышения чувствительности определения мутации V617F в гене JAK2 методом пиросеквенирования

Аннотация

Чувствительность методов, используемых для обнаружения соматической мутации V617F в гене JAK2, определяет возможности раннего выявления хронических миелопролиферативных опухолей (ХМО). Мутация V617F также может быть обнаружена у лиц, не имеющих развернутой картины гематологических заболеваний, и определение мутации даже в низких концентрациях ассоциировано с повышением риска церебрального инсульта и тромбоза артериальных и венозных сосудов. Цель данной работы заключалась в разработке методик, основанных на COLD-ПЦР и аллель-специфичной ПЦР, направленных на повышение чувствительности выявления мутации V617F, определяемой с помощью пиросеквенирования. Аналитическую чувствительность методик оценивали на контрольных образцах с различными соотношениями аллелей. Для аллель-специфичной ПЦР аналитическая чувствительность составила 0,25% мутантного аллеля при концентрации анализируемого контрольного образца 10 копий ДНК/мкл; для COLD-ПЦР — 0,5% при концентрации 10 копий ДНК/мкл. Проведена сравнительная апробация методик на клиническом материале, полученном от 106 пациентов с подозрением на ХМО. При исследовании клинических образцов методом COLD-ПЦР было обнаружено 13 (14%), а методом аллель-специфичной ПЦР — 15 (16%) положительных образцов. Во всех 15 случаях обнаружения мутации было получено клиническое подтверждение диагноза ХМО. Предложенные методики позволяют увеличить эффективность амплификации мутантной ДНК в исследуемых образцах и тем самым повысить чувствительность последующего анализа продуктов амплификации методом пиросеквенирования, что позволяет рекомендовать использование методик для подтверждения диагноза ХМО и раннего выявления лиц с повышенным риском развития венозных и артериальных тромбозов.

Об авторах

Список литературы

Tefferi A., Vardiman J.W. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: the 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms. Leukemia. 2008; 22(1): 14-22.

Nielsen C., Birgens H.S., Nordestgaard B.G., Bojesen S.E. Diagnostic value of JAK2 V617F somatic mutation for myeloproliferative cancer in 49 488 individuals from the general population. Br. J. Haematol. 2013; 160(1): 70-9.

Lippert E., Mansier O., Migeon M., Denys B., Nilsson A., Rosmond C. et al. Clinical and biological characterization of patients with low (0.1-2%) JAK2V617F allele burden at diagnosis. Haematologica. 2014; 99(7): e98-101.

Sidon P., Housni E.H., Dessars B., Heimann P. The JAK2V617F mutation is detectable at very low level in peripheral blood of healthy donors. Leukemia. 2006; 20(9): 1622.

Zhao A.H., Gao R., Zhao Z.J. Development of a highly sensitive method for detection of JAK2V617F.J. Hematol. Oncol. 2011; 4: 40.

Ольховский И.А., Столяр М.А. Особенности агрегационной активности тромбоцитов у пациентов с мутацией в гене JAK2: гендерные отличия и эффект аспирина. Гематология и трансфузология. 2014; 59(1): 11-4.

Milbury C.A., Li J., Liu P., Makrigiorgos G.M. COLD-PCR : improving the sensitivity of molecular diagnostics assays. Expert Rev. Mol. Diagn. 2011; 11(2): 159-69.

Kannim S., Thongnoppakhun W., Auewarakul C.U. Two-round allele specific-polymerase chain reaction: a simple and highly sensitive method for JAK2V617F mutation detection. Clin. Chim. Acta. 2009; 401(1-2): 148-51.

Ключевые слова