Разработка и сравнительная апробация методик для повышения чувствительности определения мутации V617F в гене JAK2 методом пиросеквенирования

Аннотация

Чувствительность методов, используемых для обнаружения соматической мутации V617F в гене JAK2, определяет возможности раннего выявления хронических миелопролиферативных опухолей (ХМО). Мутация V617F также может быть обнаружена у лиц, не имеющих развернутой картины гематологических заболеваний, и определение мутации даже в низких концентрациях ассоциировано с повышением риска церебрального инсульта и тромбоза артериальных и венозных сосудов. Цель данной работы заключалась в разработке методик, основанных на COLD-ПЦР и аллель-специфичной ПЦР, направленных на повышение чувствительности выявления мутации V617F, определяемой с помощью пиросеквенирования. Аналитическую чувствительность методик оценивали на контрольных образцах с различными соотношениями аллелей. Для аллель-специфичной ПЦР аналитическая чувствительность составила 0,25% мутантного аллеля при концентрации анализируемого контрольного образца 10 копий ДНК/мкл; для COLD-ПЦР - 0,5% при концентрации 10 копий ДНК/мкл. Проведена сравнительная апробация методик на клиническом материале, полученном от 106 пациентов с подозрением на ХМО. При исследовании клинических образцов методом COLD-ПЦР было обнаружено 13 (14%), а методом аллель-специфичной ПЦР - 15 (16%) положительных образцов. Во всех 15 случаях обнаружения мутации было получено клиническое подтверждение диагноза ХМО. Предложенные методики позволяют увеличить эффективность амплификации мутантной ДНК в исследуемых образцах и тем самым повысить чувствительность последующего анализа продуктов амплификации методом пиросеквенирования, что позволяет рекомендовать использование методик для подтверждения диагноза ХМО и раннего выявления лиц с повышенным риском развития венозных и артериальных тромбозов.